遺伝子導入による歯周組織オルガノイドティシュエンジニアリング

本年度は、前年度に確立した遺伝子導入法を用いて歯根膜細胞へ菌周組織再生関連遺伝子を導入し、導入遺伝子の発現確認をRT-PCR法を用いて行うと共にそのタンパクレベルでの分泌をウエスタンブロット法にて検出した。すなわち、セルライン化されたヒト歯根膜細胞よりPeriostinのアイソフォームTYPE IIおよびPLAP-1の全長cDNAを単離し、発現cDNA用ベクターp3XFLAG-CMV-14にクローニングすることにより各導入遺伝子を準備し、エレクトロポレーション法を用いて各遺伝子をマウス歯根膜細胞株であるMPDL22に導入し、導入遺伝子とそのタンパクレベルでの発現を前記の方法で検出した。その結果、遺伝子導入MPDL22における導入遺伝子のmRNAレベルでの発現とそのタンパクレベルでの分泌が確認できた。また、歯周組織再生を誘導する有力な幹細胞リソースに成り得る脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の足場材として歯周組織再生の空間確保に有効と考えられるβ-TCPブロックへの播種法を検討した。その結果、β-TCPブロックとADSCを陰圧付加下で共培養することにより、ADSCがβ-TCPブロックに定着し長期間生存することが明らかになった。そして、そのADSC播種β-TCPブロックをビーグル犬人工的2壁あるいは1壁性歯周組織欠損モデルに移植し観察した結果、ADSC播種β-TCPブロックは歯周組織欠損部に定着し良好な治癒が得られることが確認された。以上の結果より、本研究により確立された歯根膜細胞への遺伝子導入法とADSCをはじめとする幹細胞およびβ-TCPなどの足場材を組み合わせることにより、歯周組織再生に有効な歯周組織オルガノイドの形成の可能性が示唆された。

本年度は、前年度に確立した遺伝子導入法を用いて歯根膜細胞へ菌周組織再生関連遺伝子を導入し、導入遺伝子の発現確認をRT-PCR法を用いて行うと共にそのタンパクレベルでの分泌をウエスタンブロット法にて検出した。すなわち、セルライン化されたヒト歯根膜細胞よりPeriostinのアイソフォームTYPE IIおよびPLAP-1の全長cDNAを単離し、発現cDNA用ベクターp3XFLAG-CMV-14にクローニングすることにより各導入遺伝子を準備し、エレクトロポレーション法を用いて各遺伝子をマウス歯根膜細胞株であるMPDL22に導入し、導入遺伝子とそのタンパクレベルでの発現を前記の方法で検出した。その結果、遺伝子導入MPDL22における導入遺伝子のmRNAレベルでの発現とそのタンパクレベルでの分泌が確認できた。また、歯周組織再生を誘導する有力な幹細胞リソースに成り得る脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の足場材として歯周組織再生の空間確保に有効と考えられるβ-TCPブロックへの播種法を検討した。その結果、β-TCPブロックとADSCを陰圧付加下で共培養することにより、ADSCがβ-TCPブロックに定着し長期間生存することが明らかになった。そして、そのADSC播種β-TCPブロックをビーグル犬人工的2壁あるいは1壁性歯周組織欠損モデルに移植し観察した結果、ADSC播種β-TCPブロックは歯周組織欠損部に定着し良好な治癒が得られることが確認された。以上の結果より、本研究により確立された歯根膜細胞への遺伝子導入法とADSCをはじめとする幹細胞およびβ-TCPなどの足場材を組み合わせることにより、歯周組織再生に有効な歯周組織オルガノイドの形成の可能性が示唆された。