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in vivoナノ蛋白質工学による神経伝達物質受容体活性化の可視化解析

体内纳米蛋白工程对神经递质受体激活的可视化分析

基本信息

批准号：
16650083
负责人：
森泰生
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度は、in vivoナノタンパク質工学を目的として開発された光アフィニティーラベル化後修飾法が未知の薬の作用部位同定法として利用できることを報告した。今年度は、実際にその有効性を確認するために、我々が新たに同定した従来とは異なる作用を有する免疫抑制剤の作用部位同定にこの手法を応用した。まず、免疫抑制剤の作用部位をある程度推測するために、カルシウムイオンの流入阻害について検討した。カルシウムイメージングを利用した結果からこの薬が受容体刺激後のCa2+流入を阻害することを確認できた。流入経路はTRPCチャネルと呼ばれるチャネルであると考えられたので、各サブタイプに対する選択性についてHEK293細胞を用いた評価した。その結果、この薬はTRPC3のチャネル活性を選択的に抑制できることを見出せた。さらにホールセルモードのパッチクランプ法を用いることで、細胞外からこの薬はチャネル活性を阻害することも確認できた。TRPC3に直接この薬が作用していることを証明するために、本申請内容で提案したアフィニティーラベル化後修飾法を利用した。具体的には、この薬に対応するアフィニティーラベル化剤を有機合成し、TRPC3を過剰発現させたHEK293細胞に作用させた。光照射後に細胞膜画分を回収し、ラベル化後の選択的な修飾反応としてビオチン修飾を行った。反応進行をウェスタンブロッティングにて確認したところ、TRPC3に選択的に反応していることを確認でき、この免疫抑制剤がTRPC3に直接結合している証拠を得ることができた。以上の結果から、本研究において開発した光アフィニティーラベル化後修飾法が受容体可視化だけでなく、未知の薬の作用部位同定法としても利用できることを実証した。

In the past year, in vivo, the quality engineering purpose was to develop a method for determining the action site of unknown compounds. This year, we have to confirm that there is a new way to determine the role of immunosuppressive agents. The extent of immunosuppressive agents 'action sites is estimated. The results of this study confirm that the Ca2 + influx is inhibited by the stimulation of the host. The inflow pathway is the first step in the selection of HEK293 cells. The results showed that TRPC3 activity was inhibited by the enzyme. In addition, it has been confirmed that the balloon clamp method can be used to inhibit extracellular activity of these drugs. TRPC3 is a direct response to the application and the content of the application is subject to modification. The specific reaction of TRPC3 to HEK293 cells was studied. After light irradiation, the cell membrane is divided into two parts, and the selected part is modified. The anti-tumor agent is selected by TRPC3 and directly binds to TRPC3. The above results are demonstrated by the method of visualization of receptors and determination of unknown sites of action.