西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対する動物用経口ワクチンの研究開発

西尼罗河病毒和乙脑病毒动物口服疫苗的研发

• 批准号: 16658121
• 负责人: 只野 昌之
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: University of the Ryukyus
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658121/
• 关键词: 粘膜免疫; E型肝炎ウイルス; DNAワクチン; 節足動物媒介性ウイルス; 人獣共通感染症; バキュロウイルス発現系; 経口ワクチン; 経鼻ワクチン; 西ナイルウイルス; 日本脳炎ウイルス; バキュロウイルス; VLP; 経口免疫

E型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス様中空粒子(HEV-VLPs)を発現する組換えバキュロウイルスを接種した高発現蛾由来細胞株Tn5の感染培養上清中のHEV-VLPsをポリエチレングリコール(PEG)法あるいは超遠心法にて濃縮し、さらにショ糖密度勾配超遠心法にて精製した。精製HEV-VLPsにジチオスレイトール存在下でEGTAを添加して構成蛋白単位に開裂せしめ、既に作製済みの西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン候補とカルシウムイオンを添加してDNAワクチンを封入したHEV-VLPsを再構築させた。超遠心法で濃縮したDNAワクチン封入HEV-VLPsを培養細胞(ヒト大腸癌由来Caco-2株、ヒト咽頭癌由来HEp-2株)に接種し、酵素抗体法による検討で細胞内にDNAワクチンに由来する目的蛋白質の発現を確認した。これまでの検討で、感染培養液からのHEV-VLPs濃縮には超遠心法がロスも少なく、PEG法より優れていることがわかった。しかし、超遠心法による濃縮・精製では、一度に扱える感染培養上清量が制限される上に操作が煩雑なので、マウスを用いた免疫実験に必要な量のHEV-VLPsを得るための大量調整には簡便且つ迅速に大量の原料を扱える方法が必要である。そこで、ヒスチジンとアスパラギン(H-N)の繰り返し配列を持つHEV-core蛋白を発現する組換えバキュロウイルスを再構築し、H-N繰り返し配列に対する親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーにより、大量の感染培養上清からHEV-VLPsを精製する方法に切り替えた。

Hepatitis E ウ イ ル ス (HEV) の ウ イ ル ス others in hollow particles (HEV - VLPs) を 発 now す る group in え バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を vaccination し た high 発 now moth origin cell lines Tn5 の infection in the culture supernatant の HEV - VLPs を ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル method (PEG) あ る い は buzzer-beaters art に て concentration し, さ ら に シ ョ Sugar density blending and super-telocentric method にて refining and grinding た. Refined HEV - VLPs に ジ チ オ ス レ イ ト ー ル presence で EGTA を add し て formed protein 単 に cracking せ し め, both に system 済 み の west ナ イ ル ウ イ ル ス お よ び Japan 脳 inflammation ウ イ ル ス に す seaborne る DNA ワ ク チ ン alternate と カ ル シ ウ ム イ オ ン を add し て DNA ワ ク チ ン を し sealed た HEV - VLPs を Rebuild させた. Symbolism art で enrichment し た DNA ワ ク チ ン HEV - sealed VLPs を cultured cells (ヒ ト optimization colorectal origin Caco - 2 strains, ヒ ト those cancer origin, HEp - 2 strains) に vaccination antibody し, enzyme method に よ る beg で 検 に ワ DNA in the cell ク チ ン に origin す る purpose protein の 発 を now confirmed し た. Beg で こ れ ま で の 検, infection culture か ら の HEV - VLPs enrichment に は buzzer-beaters art が ロ ス も less な く, PEG よ り optimal れ て い る こ と が わ か っ た. し か し, symbolism art に よ る enrichment, refined で は, once に Cha え る infection on cultivating clear quantity limitations が さ れ る に が operation on the vexed 雑 な の で, マ ウ ス を with い た immune be 験 に necessary な amount の HEV - VLPs を have る た め の large adjustment に は の bulk raw materials is simple and fastest つ に を Cha え る method が necessary で あ る. そ こ で, ヒ ス チ ジ ン と ア ス パ ラ ギ ン (H - N) の Qiao り return し match column を hold つ HEV - the core protein を 発 now す る group in え バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を build し again, H, N Qiao り return し match column に す seaborne る affinity を using し た ア フ ィ ニ テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り, a large number of の infection culture supernatant か ら HEV - VL Psを refining する method に cutting verticide えた.