西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対する動物用経口ワクチンの研究開発

E型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス様中空粒子(HEV-VLPs)を発現する組換えバキュロウイルスを接種した高発現蛾由来細胞株Tn5の感染培養上清中のHEV-VLPsをポリエチレングリコール(PEG)法あるいは超遠心法にて濃縮し、さらにショ糖密度勾配超遠心法にて精製した。精製HEV-VLPsにジチオスレイトール存在下でEGTAを添加して構成蛋白単位に開裂せしめ、既に作製済みの西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン候補とカルシウムイオンを添加してDNAワクチンを封入したHEV-VLPsを再構築させた。超遠心法で濃縮したDNAワクチン封入HEV-VLPsを培養細胞(ヒト大腸癌由来Caco-2株、ヒト咽頭癌由来HEp-2株)に接種し、酵素抗体法による検討で細胞内にDNAワクチンに由来する目的蛋白質の発現を確認した。これまでの検討で、感染培養液からのHEV-VLPs濃縮には超遠心法がロスも少なく、PEG法より優れていることがわかった。しかし、超遠心法による濃縮・精製では、一度に扱える感染培養上清量が制限される上に操作が煩雑なので、マウスを用いた免疫実験に必要な量のHEV-VLPsを得るための大量調整には簡便且つ迅速に大量の原料を扱える方法が必要である。そこで、ヒスチジンとアスパラギン(H-N)の繰り返し配列を持つHEV-core蛋白を発現する組換えバキュロウイルスを再構築し、H-N繰り返し配列に対する親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーにより、大量の感染培養上清からHEV-VLPsを精製する方法に切り替えた。

E型肝炎ウイルス(HEV)のウイルス様中空粒子(HEV-VLPs)を発現する組換えバキュロウイルスを接種した高発現蛾由来細胞株Tn5の感染培養上清中のHEV-VLPsをポリエチレングリコール(PEG)法あるいは超遠心法にて濃縮し、さらにショ糖密度勾配超遠心法にて精製した。精製HEV-VLPsにジチオスレイトール存在下でEGTAを添加して構成蛋白単位に開裂せしめ、既に作製済みの西ナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン候補とカルシウムイオンを添加してDNAワクチンを封入したHEV-VLPsを再構築させた。超遠心法で濃縮したDNAワクチン封入HEV-VLPsを培養細胞(ヒト大腸癌由来Caco-2株、ヒト咽頭癌由来HEp-2株)に接種し、酵素抗体法による検討で細胞内にDNAワクチンに由来する目的蛋白質の発現を確認した。これまでの検討で、感染培養液からのHEV-VLPs濃縮には超遠心法がロスも少なく、PEG法より優れていることがわかった。しかし、超遠心法による濃縮・精製では、一度に扱える感染培養上清量が制限される上に操作が煩雑なので、マウスを用いた免疫実験に必要な量のHEV-VLPsを得るための大量調整には簡便且つ迅速に大量の原料を扱える方法が必要である。そこで、ヒスチジンとアスパラギン(H-N)の繰り返し配列を持つHEV-core蛋白を発現する組換えバキュロウイルスを再構築し、H-N繰り返し配列に対する親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーにより、大量の感染培養上清からHEV-VLPsを精製する方法に切り替えた。