Identification of compounds that inhibit the early and late steps of hepatitis E virus infection and analysis of their inhibitory effects on the virus growth

抑制戊型肝炎病毒感染早期和晚期的化合物的鉴定及其对病毒生长的抑制作用分析

• 批准号: 22K07105
• 负责人: 長嶋 茂雄
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07105/
• 关键词: E型肝炎ウイルス; レポーターウイルス; 生物発光タンパク質; HiBiTタグ; ウイルス放出; 薬剤スクリーニング; レポーターアッセイ; 化合物; スクリーニング; 増殖抑制

本研究は、E型肝炎ウイルス (HEV) の感染初期過程と後期過程を阻害する化合物を同定することである。これまでに、HEVのORF1蛋白質（非構造蛋白質）にnanoKAZ遺伝子を搭載した感染性を有するリコンビナントHEVの開発に成功しており、これによりHEVの感染初期過程（吸着および侵入）を阻害する薬剤のスクリーニングが可能となった。本年度は、感染後期過程を阻害する薬剤を同定するための新規スクリーニング系を開発するために、HEVのORF2蛋白質（構造蛋白質）にHiBiTタグを搭載した感染性のリコンビナントウイルスを作製した。ORF2蛋白質にHiBiT配列を挿入した組換えHEV RNAを導入したPLC/PRF/5細胞では、培養上清中に膜に覆われたHEV粒子 (eHEV) が産生され、挿入したHiBiT配列も維持されていた。また、培養上清中のeHEV-HiBiTを新たな細胞に接種したところ、感染性が認められた。ORF2蛋白質に融合したHiBiTは、脂質膜の内側に発現しているが、eHEV-HiBiT粒子を界面活性剤で処理することにより検出が可能であった。そこで、薬剤スクリーニングに応用するために、siRNAを用いて細胞内のTsg101、Rab27A、Hrsをノックダウンした細胞にHEV-HiBiT RNAを導入し、4日後に培養上清中の膜に覆われたHEVをHiBiTシステムにより検出した結果、放出効率の低下が認められた。膜に覆われたHEVは、宿主細胞のエクソソーム分泌経路を利用して細胞外へと放出される。そこで、HEVの放出を阻害する薬剤を同定するために、エクソソーム化合物ライブラリを用いて薬剤スクリーニングを実施した。その結果、HEVの放出を阻害することにより抗HEV活性を示す複数の薬剤を同定することができた。

This study aimed to identify compounds that inhibit the early and late stages of HEV infection. The ORF1 protein (non-structural protein) of HEV carries the nanoKAZ gene and successfully inhibits the development of HEV in the early stages of infection (adsorption and invasion). This year, the development of new infection systems and the development of new infectious diseases ORF2 protein is incorporated into the HiBiT sequence and HEV RNA is introduced into PLC/PRF/5 cells, and HEV particles (eHEV) are produced and incorporated into the culture supernatant. EHEV-HiBiT in culture supernatant is inoculated with new cells, and infectivity is recognized. ORF2 protein fusion and lipid membrane development, eHEV-HiBiT particle interfacial activity and treatment Therefore, when HEV-HiBiT RNA was introduced into Tsg101, Rab27A, and Hrs cells using siRNA, HEV was detected in the HiBiT system 4 days later when HEV was coated on the membrane in the culture supernatant, and the release efficiency was low. The membrane is covered with HEV, and the host cell is used to release extracellular protein. For example, if the HEV emission is not stable, the compound will be used. The result is that the HEV emission is inhibited, and the HEV activity is inhibited.

项目成果

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Subclinical hepatitis E virus (HEV) infection detected by nucleic acid amplification test on blood donation: short-term positivity for immunoglobulin G class of antibody against HEV

献血核酸扩增检测发现亚临床戊型肝炎病毒（HEV）感染：HEV免疫球蛋白G类抗体短期阳性

• DOI: 10.1007/s12328-022-01635-3
• 发表时间: 2022
• 期刊: Clinical Journal of Gastroenterology
• 影响因子: 1
• 作者: Hasegawa Izumi;Nakano Tatsunori;Koguchi Hiroki;Jinno Naruomi;Hirashima Noboru;Nagashima Shigeo;Takahashi Masaharu;Murata Kazumoto;Okamoto Hiroaki
• 通讯作者: Okamoto Hiroaki