細胞内pHの日周変動を測定するプローブの開発

地球上の多くの生物は昼夜に連動した24時間周期で活動する。この周期性を支える体内時計に関し分子→細胞→組織→個体のあらゆる階層で研究が盛んに行われている。よって体内時計を理解するための基盤技術の構築は重要な研究開発要素である。本研究では、核内で変動する時計遺伝子群が細胞内生理をどのように制御し体内時計が変動するか?或いは細胞内生理の変化がどのように体内時計遺伝子を制御するか?が重要であると考え、これまで充分に考察されていない体内時計の指標の一つである細胞内pH変動に着目した。そこで、pH変動を生きた哺乳類細胞においてモニタリングできるホタルルシフェラーゼ分子プローブの構築及び、本システムを用いた細胞内pH日周変動測定を目的とした。これまでに細胞内pH変動をモニタリングできるホタルルシフェラーゼ分子プローブとしてホタルルシフェラーゼ変異体を哺乳類細胞用に最適化を行い、pH8-7、7-6で発光色が変化する変異体を作成できた。本年度は、細胞内のオルガネラレベルでのpH変動をモニターするため、ホタルルシフェラーゼ変異体を細胞内オルガネラに局在化できるシグナル配列について検討した。細胞膜、細胞質、ミトコンドリア、ER及びペルオキシゾームシグナル配列を導入したルシフェラーゼ変異体を作成、発光活性が20-80%に変動すること、及び、シグナル配列に従って細胞内局在が変化することを明らかにした。今後、細胞内オルガネラレベルでpH変動がモニターできるか検討する予定である。

地球上の多くの生物は昼夜に連動した24時間周期で活動する。この周期性を支える体内時計に関し分子→細胞→組織→個体のあらゆる階層で研究が盛んに行われている。よって体内時計を理解するための基盤技術の構築は重要な研究開発要素である。本研究では、核内で変動する時計遺伝子群が細胞内生理をどのように制御し体内時計が変動するか?或いは細胞内生理の変化がどのように体内時計遺伝子を制御するか?が重要であると考え、これまで充分に考察されていない体内時計の指標の一つである細胞内pH変動に着目した。そこで、pH変動を生きた哺乳類細胞においてモニタリングできるホタルルシフェラーゼ分子プローブの構築及び、本システムを用いた細胞内pH日周変動測定を目的とした。これまでに細胞内pH変動をモニタリングできるホタルルシフェラーゼ分子プローブとしてホタルルシフェラーゼ変異体を哺乳類細胞用に最適化を行い、pH8-7、7-6で発光色が変化する変異体を作成できた。本年度は、細胞内のオルガネラレベルでのpH変動をモニターするため、ホタルルシフェラーゼ変異体を細胞内オルガネラに局在化できるシグナル配列について検討した。細胞膜、細胞質、ミトコンドリア、ER及びペルオキシゾームシグナル配列を導入したルシフェラーゼ変異体を作成、発光活性が20-80%に変動すること、及び、シグナル配列に従って細胞内局在が変化することを明らかにした。今後、細胞内オルガネラレベルでpH変動がモニターできるか検討する予定である。