新規高輝度生物発光基質セレンテラジン誘導体の設計と合成

新型高亮度生物发光底物腔肠素衍生物的设计与合成

• 批准号: 16J05500
• 负责人: 西原 諒
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J05500/
• 关键词: 生物発光; セレンテラジン; レニラルシフェラーぜ; 人工生物発光酵素; バイオイメージング; タンパク質間相互作用; バイオ分析; デュアルレポーターアッセイ; バイオケミカルセンサー; イメージングプローブ; 蛍光タンパク質; ルシフェリン; ルシフェラーゼ; 化学センサー

本研究では“セレンテラジン(CTZ)”を発光基質に持つ発光酵素レニラルシフェラーゼ(RLuc)と人工発光酵素(ALuc)による高感度生物発光プローブの創製を目指した。まず発光強度の改善を狙い、約50種類以上のCTZ誘導体を合成、酵素との網羅的構造活性相関研究を行う事で、CTZの2位または6位炭素における置換基改変による生物発光特性への影響を詳細に調べた。更に新規基質と共同で開発した新規発光酵素を組み合わせる事で、新たなバイオアッセイ系の確立に成功した。1.高輝度生物発光基質と革新的バイオアッセイ系の確立発光酵素RLucの変異体(RLuc8.6)において、基質CTZの有用改変可能部位を初めて見出した。新規基質は市販品のブルーシフト基質DeepBlueCと比較すると約25倍の発光強度を持つ。更に、他の生物発光酵素ALucにおいても有意な発光を示し、これまでに金属イオンや細胞内タンパク質間相互作用解析等、様々なバイオアッセイ系への応用を行う事でその実用性を示してきた。これらの知見を基にCTZ誘導体20種類を新たに設計、発光酵素ALuc並びにRLucに各々特異的に反応する新規基質開発に着手した。これら新規基質とALucまたはRLucに基づくタンパク質間相互作用可視化プローブを組み合わせる事で、2種類のタンパク質間相互作用を同時に解析するデュアルレポーターアッセイ系の開発に初めて成功した。2.超高輝度生物発光基質開発と生体イメージングへの応用CTZとRLuc8のドッキングシミュレーション結果を基に20種のCTZ誘導体を開発、更なる高輝度化を図った。結果として生細胞においてDeepBlueCの約50倍の発光強度を持つ高輝度基質開発に成功した。新規基質は、高解像度での一細胞イメージングだけでなく、赤色発光酵素と組み合わせる事でCTZより高感度な生体内イメージングも可能にした。

This study で は "セ レ ン テ ラ ジ ン (CTZ)" を 発 light matrix に hold つ 発 light enzyme レ ニ ラ ル シ フ ェ ラ ー ゼ (RLuc) と artificial enzyme (ALuc) 発 light に よ る Gao Gan degree of biological 発 light プ ロ ー ブ の created を refers し た. ま ず 発 light intensity の improve を previously い, more than about 50 species の CTZ inductor を synthesis, enzyme と の snare the structure of the active phase masato を line で う, CTZ の two ま た は six carbon に お け る replacement gm - に よ る biological 発 light feature へ の influence を detailed に adjustable べ た. More に と で together to open the new rules matrix 発 し た new rules 発 light enzyme を group み close わ せ で る, new た な バ イ オ ア ッ セ イ is の establish に successful し た. 1. The degree of micromixer mixing effect biological 発 light matrix と innovative バ イ オ ア ッ セ イ is の establish 発 light enzyme RLuc の - variants (RLuc8.6) に お い て, matrix CTZ の useful change - at the beginning of may place を め て shows し た. The new regulation substrate <s:1> commercially available products <s:1> ブ <s:1> シフト シフト シフト the と of the シフト substrate DeepBlueCと is approximately 25 times the すると in terms of <s:1> light emission intensity を and maintains ブ. More に, he の biological enzyme ALuc 発 light に お い て も intentionally な 発 light を し, こ れ ま で に metal イ オ ン や intracellular タ ン パ ク qualitative analytical, others such as interaction between 々 な バ イ オ ア ッ セ イ department へ の 応 with を doeth う で そ の be use sex を shown し て き た. こ れ ら の knowledge を base に CTZ inductor 20 kinds を new た に design, ALuc 発 light enzyme and び に RLuc に 々 each specific に anti 応 す る open new rules matrix 発 に to し た. こ れ ら new rules matrix と ALuc ま た は RLuc に base づ く タ ン パ ク qualitative interaction between visual プ ロ ー ブ を group み close わ せ で る, 2 species の タ ン パ ク qualitative interaction between を に analytical at the same time す る デ ュ ア ル レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ started の 発 に early め て successful し た. 2. High luminance biological 発 light matrix open 発 と raw body イ メ ー ジ ン グ へ の 応 with CTZ と RLuc8 の ド ッ キ ン グ シ ミ ュ レ ー シ ョ ン results を に 20 の CTZ inductor を 発, more な る micromixer mixing effect degree melts を 図 っ た. The results showed that the と て て て living cells にお て てDeepBlueC <s:1> with about 50 times the <s:1> luminescence intensity を maintained the <s:1> high luminescence matrix and successfully developed に た. New rules matrix は, high resolution で の a cell イ メ ー ジ ン グ だ け で な く, red light 発 enzyme と group み わ せ る matter で CTZ よ り Gao Gan degrees な born in vivo イ メ ー ジ ン グ も may に し た.

项目成果

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高速バイオアッセイによる革新的な医療・環境診断への期待

对使用高速生物测定的创新医疗和环境诊断的期望

Luciferase-Specific Coelenterazine Analogues for Optical Contamination-Free Bioassays.

• DOI: 10.1038/s41598-017-00955-6
• 发表时间: 2017-04-19
• 期刊: Scientific reports
• 影响因子: 4.6
• 作者: Nishihara R;Abe M;Nishiyama S;Citterio D;Suzuki K;Kim SB
• 通讯作者: Kim SB

Fabrication of Blue-Shifted Coelenterazine Derivatives for Bioluminescent Applications

用于生物发光应用的蓝移腔肠素衍生物的制备

• 发表时间: 2016
• 作者: Ryo Nishihara;Takahiro Nakajima;Sung-Bae Kim;Moritoshi Sato;Shigeru Nishiyama;Naoko Iwasawa;Daniel Citterio;Koji Suzuki
• 通讯作者: Koji Suzuki

生物発光イメージングのための合成生物発光基質セレンテラジン誘導体

用于生物发光成像的合成生物发光底物腔肠素衍生物

• 发表时间: 2017
• 作者: Ryo Nishihara;Masahiro Abe;Shigeru Nishiyama;Daniel Citterio;Koji Suzuki;Sung Bae Kim;Ryo Nishihara;西原諒
• 通讯作者: 西原諒