HVJエンベロープ法による脊髄保護因子の蛋白導入を応用した新しい脊髄保護法の開発

利用 HVJ 包膜法引入脊髓保护因子蛋白，开发新的脊髓保护方法

• 批准号: 16659371
• 负责人: 高野 弘志
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16659371/
• 关键词: 虚血性脊髄障害; 遺伝子導入; HVJ-E

1 実験動物による脊髄虚血モデルの作成Japanese white rabbit(2.5Kg-3.0Kg)を用いて脊髄虚血モデルを作成した。大腿動脈より4Fr Fogarty catherterを挿入し、腎動脈下でinflationし脊髄虚血にした。15分虚血後reperfusionし、一週間後犠牲死するまで神経学的評価を毎日行い、犠牲死させたあと組織学的評価を行なった。また各蛋白の発現をみるために別にreperfusion後、8hr,24hr,48hr後に犠牲死させた。A)神経学的評価下肢運動評価は肉眼的所見としてJohnson scoreを用いて(0から5点、正常が5点)行った。虚血後2日目の平均scoreは4.4±1.2(n=5)でほぼ正常下肢運動能を保ったが、7日目には2.2±1.3(n=5)であり、遅発性下肢運動麻痺を示した。B)組織学的評価H-E染色にて虚血2日目の生存motor neuron数はsham control群(19.0±1.0),脊髄虚血群(18.0±2.3)と変化はないものの術後7日目には、sham群に比べ60%のmotor neuronが選択的に減少(7.8±3.1:p<0.0001)。15分虚血後motor neuronは2日間生存するが、それ以降選択的に細胞死した。またTUNEL染色にても2日目までにTUNEL陽性細胞を認め、細胞死にapoptosisの関与が示唆された。また免疫染色により虚血後8時間目にstress induce proteinであるHeat shock proteinが発現されていた。また免疫染色によりangiogenic factorであるVEGFの発現は虚血後8時間に認められた。またWestern blotting法にて同様に両蛋白の発現が認められた。2 non-viral vector HVJ-Eを用いた遺伝子脊髄導入実験luciferase遺伝子、Venus遺伝子をそれぞれHVJ-Eに封入し実験動物への脊髄へ導入する。導入後luciferase活性を検討し導入効率を定量化し、またVenus遺伝子を導入し組織学的に脊髄の導入される局在を検討した。まずバルーンを腎動脈直下で閉塞させたあと、もう一つのバルーンを大動脈分岐部に位置させて、このバルーン先端よりluciferase遺伝子、Venus遺伝子をそれぞれ封入したHVJ-Eを注入し、腰動脈より脊髄へ経動脈的にtransfectionを行った。しかし摘出脊髄からはluciferase活性は認められず、また病理学的にもVenusの発現は認めなかった。経動脈的に脊髄へのHVJ-Eを用いた遺伝子導入は困難であり、今後脊髄への直接穿刺による遺伝子導入を行う予定である。

1 be 験 animal に よ る spinal marrow blood deficiency モ デ ル の made Japanese white rabbit (2.5 Kg - 3.0 Kg) を い て spinal marrow deficiency blood モ デ ル を made し た. The thigh artery よ を 4Fr Fogarty catherterを inserted into the <s:1>, the subrenal artery でinflation the spinal cord of the <s:1> deficient blood に た た. 15 points of reperfusion after blood deficiency, one week later, the evaluation of sacrifice death するまで theologian 価を daily performance するまで, the evaluation of sacrifice death させたあと histology 価を performance なった. ま た each protein の 発 now を み る た め に don't に, 8 hr after reperfusion, 24 hr, after 48 hr に bloods die さ せ た. A) god 経 learning evaluation 価 lower limb movement review 価 は the naked eye can see と し て Johnson score を with い て (0 か ら 5, normal が five) line っ た. Virtual blood after 2 orders の average score は 4.4 + / - 1.2 (n = 5) で ほ ぼ normal lower limb movement を "control っ た が, 7 orders に は 2.2 + / - 1.3 (n = 5) で あ り, 遅 発 sex lower limb movement paralysis を shown し た. B) Histological evaluation: 価H-E staining にて deficiency blood 2 days later <s:1> survival motor neuron number にて sham control group (19.0±1.0), spinal cord deficiency blood group (18.0±2.3)と change な な <s:1> <s:1> <s:1> 7 days after surgery に に and sham group に compared べ60% of the motor neuronが select 択 and に decrease (7.8±3.1:p<0.0001). After 15 minutes of hypoglycemic blood, motor neurons survive するが and それ within 2 days, and に cells selected 択 die 択 た. Youdaoplaceholder0 TUNEL staining にて にて 2-day までに tunel-positive cells を recognize め, cell death にapoptosis <s:1> is associated with が indicating された. Youdaoplaceholder0 immunostaining によ <s:1> after 8 hours of deficient blood, にstress induce proteinであるHeat shock proteinが occurs されて されて た た. ま た immune dyeing に よ り angiogenic factor で あ る VEGF の 発 now は 8 time after holding blood に recognize め ら れ た. Youdaoplaceholder0 Western blotting にて is similar to に. Two proteins are found to have が recognition められた. 2 non - viral vector HVJ - E を with い た posthumous son 伝 spinal marrow import be 験 luciferase heritage 伝 son, Venus but 伝 を そ れ ぞ れ HVJ - E に し sealed be 験 animal へ の spinal marrow へ import す る. After import luciferase activity を 検 を し ration for し import services rate, ま た Venus heritage 伝 son を import し histological に spinal marrow の import さ れ る bureau in を beg し 検 た. ま ず バ ル ー ン を renal artery by で occlusion さ せ た あ と, も う a つ の バ ル ー ン を artery bifurcation position department に さ せ て, こ の バ ル ー ン apex よ り luciferase heritage 伝 son, Venus but 伝 を そ れ ぞ れ し sealed た HVJ - E を injection し, lumbar よ り spinal marrow へ 経 arterial に transfection Youdaoplaceholder0 lines った. し か し pick the spinal marrow か ら は は luciferase activity recognition め ら れ ず, ま た pathology に も Venus の 発 は now recognize め な か っ た. 経 arterial に spinal marrow へ の HVJ - E を with い た posthumous son 伝 import は difficult で あ り, the next ridge marrow へ の direct puncture に よ る heritage 伝 son import line を う designated で あ る.