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能動的遺伝子導入による革新的ノックイン技術の開発

通过主动基因转移开发创新的敲入技术

基本信息

批准号：
22K19246
负责人：
築山智之
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Shiga University of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19246/
关键词：
ゲノム編集ノックインカニクイザル

项目摘要

CRISPR/Cas9を始めとするゲノム編集技術により、これまでに様々な遺伝子改変動物が作られるようになってはいるものの、相同組換えによる大きなフラグメントのノックインは依然として効率が悪いことが知られている。申請者が所属する滋賀医科大学では、カニクイザルにおけるゲノム編集研究を積極的に推進しているが、サルを用いる場合、マウスのように単純に試行数を増やすことで効率の問題を回避するということが倫理的に難しく、現状の効率ではノックイン実験は難しい状況である。そこで、本研究では、トランスポゾンあるいは内在性の相同組換え機構を用い、「能動的」にゲノム挿入を行う革新的なノックイン手法を確立することを目的とした。もし効率よくノックインを誘導することが可能になれば、カニクイザルを含めた大動物のみならず、全てを置き換えるポテンシャルを秘めた意欲的な研究である。本研究では、切断活性を持たない変異型Cas9であるdCas9を、トランスポゾンの転移酵素、あるいは内在性相同組換え関連遺伝子と融合させ、ノックイン効率を向上できないか検討を行う。本年度はまず、トランスポゾンの転移酵素とdCas9との融合タンパク質を発現するベクターを構築した。また、内在性の相同組換え機構において働くことが知られている複数の遺伝子のクローニングを行い、dCas9との融合タンパク質を発現するベクターを構築した。それらのベクターを用い、293細胞、マウスES細胞、カニクイザルES細胞において、標的配列を切断できるか検証した。また、その他のHDR経路の関連タンパク質の強制発現や化学的阻害剤を駆使し、内在性の相同組換えに近い状態に誘導するために相乗的に働く因子の探索を行った。

CRISPR/Cas9 is the first to use compilation techniques, and the second to use the same techniques. Shiga Medical University, to which the applicant belongs, actively promotes research on ethics, increases the number of trials, and avoids the current situation. This study is aimed at establishing the same mechanism of internal transformation, active transformation and innovative transformation. The first step is to increase the number of people who are interested in the study. In this study, we investigated the activity of Cas9, Cas This year, we will continue to build up the infrastructure for the development of fusion enzymes and dCas9. The same set of mechanisms, intrinsic to the structure, are known to be in place, and the structure of the fusion mechanism is known to be in place. For example, 293 cells, ES cells, ES cells, and target alignment were cut off. To explore the relationship between the chemical resistance agent and the chemical resistance factor of the HDR circuit, and to explore the relationship between the chemical resistance agent and the chemical resistance factor.