変形性関節症で誘導される軟骨特異的遺伝子CILPのプロモーター解析

1.CILPの成長軟骨における発現パターンの解析前年度作成した抗CILPポリクロナール抗体の特異性をCILPの強制発現系を用いて確認した。N末端側、C末端側の両エピトープにおいてペプチド抗体を作成したが、作成した抗体はウェスタンブロッティングにおいて感度、特異度とも間題なかったため、発生肢において免疫染色を行いその局在をみた。組織レベルの解析と同様CILPの発現は成長軟骨および筋肉に強く認めた。とくに軟骨においては増殖軟骨細胞層から前肥大軟骨細胞層にシグナルが検出され、SOX5/6の発現パターンにオーバーラップしていた。2.CILPの転写活性化に働く新規分子のクローニング前年度にしぼりこんだDSOXRE1を3コピー重ねたDNA配列をベイトにヒト軟骨、マウスエンブリオ由来のcDNAライブラリーを用いてワンハイブリッドアッセイ、およびサウスウェスタンスクリーニングを行って結合転写因子の候補を得た。得られた約30個の候補分子のうちp63とZNF18がCILPのプロモーターを特異的に活性化した。SOX5、SOX6との直接の協調的な作用は明らかではなく、さらに他の分子が介在している可能性が高いが、p63はHeLa細胞に単独でCILP mRNAを誘導可能であるばかりでなく、II型コラーゲン、SOX6、SOX9などさまざまなプロモーターの転写を活性化した。また、ZNF18はCILP以外の軟骨特異的遺伝子への反応性は小さかったが、抗アポトーシス分子であるBCL2のプロモータに高い反応性を示し、このさいp63と協調的に作用した。SOXトリオの抗アポトーシス作用の一部はp63やZNF18との協調作用によって生じている可能性が示された。

1.CILPの成長軟骨における発現パターンの解析前年度作成した抗CILPポリクロナール抗体の特異性をCILPの強制発現系を用いて確認した。N末端側、C末端側の両エピトープにおいてペプチド抗体を作成したが、作成した抗体はウェスタンブロッティングにおいて感度、特異度とも間題なかったため、発生肢において免疫染色を行いその局在をみた。組織レベルの解析と同様CILPの発現は成長軟骨および筋肉に強く認めた。とくに軟骨においては増殖軟骨細胞層から前肥大軟骨細胞層にシグナルが検出され、SOX5/6の発現パターンにオーバーラップしていた。2.CILPの転写活性化に働く新規分子のクローニング前年度にしぼりこんだDSOXRE1を3コピー重ねたDNA配列をベイトにヒト軟骨、マウスエンブリオ由来のcDNAライブラリーを用いてワンハイブリッドアッセイ、およびサウスウェスタンスクリーニングを行って結合転写因子の候補を得た。得られた約30個の候補分子のうちp63とZNF18がCILPのプロモーターを特異的に活性化した。SOX5、SOX6との直接の協調的な作用は明らかではなく、さらに他の分子が介在している可能性が高いが、p63はHeLa細胞に単独でCILP mRNAを誘導可能であるばかりでなく、II型コラーゲン、SOX6、SOX9などさまざまなプロモーターの転写を活性化した。また、ZNF18はCILP以外の軟骨特異的遺伝子への反応性は小さかったが、抗アポトーシス分子であるBCL2のプロモータに高い反応性を示し、このさいp63と協調的に作用した。SOXトリオの抗アポトーシス作用の一部はp63やZNF18との協調作用によって生じている可能性が示された。