TNFスーパーファミリーを利用した軟骨再生薬開発のための基礎研究

ヒト間葉系幹細胞を用いたin vitro 軟骨分化モデルの構築を行った。４種類のTNFスーパーファミリー分子LTA、TRAIL、VEGI、GITRLについて293細胞にアデノウィルスベクターを導入パッケージング、発現を確認した。LTAについては、パッケージングに時間がかかり現在効果検証中、VEGIについては発現に問題がありベクターの再構築が必要であった。一方GITRLとTRAILについてはヒトMSCに導入した場合、導入後１週間程度の早期からCOL2A1, SOX6, SOX9など軟骨の初期分化マーカーのmRNA誘導と、ALP染色陽性、alcian blue 染色陽性で示される軟骨基質の産生を認め、強い軟骨誘導能を認めた。とくにGITRLについてはパネルRNAを用いたRT-PCRによる解析で軟骨組織・軟骨細胞にかなり特異的に高発現していることが確認され軟骨分化誘導薬の候補として有望ではないかと考えられた。特異的受容体であるGITRの発現も同様に軟骨特異的であったためGITRのアデノウィルス発現系を作成したところGITRもヒト間葉系細胞を軟骨細胞様に分化させることが明らかになった。GITR/GITRLの組み合わせでさらに軟骨分化は促進された。市販の精製済みGITRLを使用して軟骨分化に必要な濃度を検証したところGITRLは従来の生理的な活性濃度よりかなり高濃度の100 ng/mL程度で軟骨分化誘導を促すことが明らかになった。現在リガンド・リセプターにGFPを挟みこんだ形の強制発現系を作成し恒常活性型の軟骨分化誘導因子としてワークするか検証中である。また末梢血由来の単核球分画にNFkBシグナルの転写因子RELAをアデノウィルスで導入すると間葉系幹細胞様の紡錘形細胞に一部分化することが分かったので、この細胞を増殖させたin vitro軟骨分化モデルを現在作成中である

ヒト間葉系幹細胞を用いたin vitro 軟骨分化モデルの構築を行った。４種類のTNFスーパーファミリー分子LTA、TRAIL、VEGI、GITRLについて293細胞にアデノウィルスベクターを導入パッケージング、発現を確認した。LTAについては、パッケージングに時間がかかり現在効果検証中、VEGIについては発現に問題がありベクターの再構築が必要であった。一方GITRLとTRAILについてはヒトMSCに導入した場合、導入後１週間程度の早期からCOL2A1, SOX6, SOX9など軟骨の初期分化マーカーのmRNA誘導と、ALP染色陽性、alcian blue 染色陽性で示される軟骨基質の産生を認め、強い軟骨誘導能を認めた。とくにGITRLについてはパネルRNAを用いたRT-PCRによる解析で軟骨組織・軟骨細胞にかなり特異的に高発現していることが確認され軟骨分化誘導薬の候補として有望ではないかと考えられた。特異的受容体であるGITRの発現も同様に軟骨特異的であったためGITRのアデノウィルス発現系を作成したところGITRもヒト間葉系細胞を軟骨細胞様に分化させることが明らかになった。GITR/GITRLの組み合わせでさらに軟骨分化は促進された。市販の精製済みGITRLを使用して軟骨分化に必要な濃度を検証したところGITRLは従来の生理的な活性濃度よりかなり高濃度の100 ng/mL程度で軟骨分化誘導を促すことが明らかになった。現在リガンド・リセプターにGFPを挟みこんだ形の強制発現系を作成し恒常活性型の軟骨分化誘導因子としてワークするか検証中である。また末梢血由来の単核球分画にNFkBシグナルの転写因子RELAをアデノウィルスで導入すると間葉系幹細胞様の紡錘形細胞に一部分化することが分かったので、この細胞を増殖させたin vitro軟骨分化モデルを現在作成中である