イネのプロモーター解析に向けた多重ターゲティング

本課題では、イネのターゲティング実験系をさらに多様な遺伝子機能解析法として発展させることを目指し、1)標的とする遺伝子のプロモーターの下流にGUSリポーター遺伝子を相同組換えを介したターゲットによって挿入し、標的遺伝子の発現制御を高精度に解析するシステムを検討し、2)さらにハイグロマイシン耐性以外のポジティブ:ネガティブ選抜マーカーを用いたターゲティング・ベクターを構築して、2遺伝子のターゲット形質転換を同時に行う多重ターゲット法への応用について探究することとした。平成18年度は、プロモーター解析用のターゲティング基本ベクターを用いてSWI/SNF遺伝子のプロモーター発現が検出できなかったことを解決するために、大腸菌での相同組換えを利用して、余分な制限酵素のサイトを完全に除去した高精度のプロモーター解析用ターゲティング基本ベクターを同様の遺伝子について構築し直した。次いで、ターゲティング形質転換法も大幅に改良して、同ターゲティングベクターの導入を試みたところ、カルスでの相同領域のPCR解析を行ったところ、12個のPCRポジティブカルスを得ることができた。次いでこれらのカルスのGUS活性を染色して調べたところ、すべてのカルスにおいて、同程度のGUS発現を見出すことができた。このことから、目的としたプロモーター解析のためのターゲティング実験系の基盤が確立されたと結論した。また、多重ターゲティングを実践すべく、ハイグロマイシン耐性以外の第2のポジティブマーカーとして、カナマイシン耐性の遺伝子のパロモマイシンに対する選抜状況を調べたところ、ハイグロマイシン耐性の選抜と比較して遜色ない効率でWaxy遺伝子の削除改変用のベクターとして構築して、ターゲティング形質転換を継続したが、Waxy遺伝子の削除改変を行った場合はこれまでの相同組換えとは異なる組換えが生じている可能性が高まってきた。そのため、次世代のホモ型組換え植物を用いて、塩基配列の詳しい解析をおこなう予定で、植物育成を進めている。

本課題では、イネのターゲティング実験系をさらに多様な遺伝子機能解析法として発展させることを目指し、1)標的とする遺伝子のプロモーターの下流にGUSリポーター遺伝子を相同組換えを介したターゲットによって挿入し、標的遺伝子の発現制御を高精度に解析するシステムを検討し、2)さらにハイグロマイシン耐性以外のポジティブ:ネガティブ選抜マーカーを用いたターゲティング・ベクターを構築して、2遺伝子のターゲット形質転換を同時に行う多重ターゲット法への応用について探究することとした。平成18年度は、プロモーター解析用のターゲティング基本ベクターを用いてSWI/SNF遺伝子のプロモーター発現が検出できなかったことを解決するために、大腸菌での相同組換えを利用して、余分な制限酵素のサイトを完全に除去した高精度のプロモーター解析用ターゲティング基本ベクターを同様の遺伝子について構築し直した。次いで、ターゲティング形質転換法も大幅に改良して、同ターゲティングベクターの導入を試みたところ、カルスでの相同領域のPCR解析を行ったところ、12個のPCRポジティブカルスを得ることができた。次いでこれらのカルスのGUS活性を染色して調べたところ、すべてのカルスにおいて、同程度のGUS発現を見出すことができた。このことから、目的としたプロモーター解析のためのターゲティング実験系の基盤が確立されたと結論した。また、多重ターゲティングを実践すべく、ハイグロマイシン耐性以外の第2のポジティブマーカーとして、カナマイシン耐性の遺伝子のパロモマイシンに対する選抜状況を調べたところ、ハイグロマイシン耐性の選抜と比較して遜色ない効率でWaxy遺伝子の削除改変用のベクターとして構築して、ターゲティング形質転換を継続したが、Waxy遺伝子の削除改変を行った場合はこれまでの相同組換えとは異なる組換えが生じている可能性が高まってきた。そのため、次世代のホモ型組換え植物を用いて、塩基配列の詳しい解析をおこなう予定で、植物育成を進めている。