レーザーマイクロダイセクションのためのRNase-free超迅速免疫染色法の確立

激光显微切割无RNase超快速免疫染色方法的建立

• 批准号: 17659051
• 负责人: 目黒 玲子
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659051/
• 关键词: 細胞・組織; 神経科学; 脳・神経; マイクロダイセクション

Cy3で直接標識した1次抗体を使った短時間免疫染色では、非特異的染色の可能性を否定しきれず、また、コストの面も問題であった。そこで、従来の2段階の免疫組織化学で、高感度かつ抗原特異性の高い、短時間染色条件を検索した。ラット大脳皮質を材料とし、介在ニューロンが持つカルビンディンたんぱく(CB)の免疫組織化学をおこなった。正常所見では、大脳皮質の浅層には弱いCB免疫染色性、深層には強い免疫染色性を示す介在ニューロンが分布する。固定法の比較RNA保存性のよいアセトン固定(3分間)を施した組織((1))と、ホルマリン固定をごく短時間(1分間)おこなった組織((2))で比較した。いずれも10μm厚切片。界面活性剤および正常ロバ血清を含む燐酸塩緩衝塩化ナトリウム液(t-s-PBS)で、抗CB抗体(ウサギ免疫グロブリン)を500倍希釈し、1時間(1)および(2)と反応させた。緩衝液で洗浄後、t-s-PBSで100倍希釈したCy3標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体と15分間反応させ、観察した。(1)では1大脳皮質浅層では標識ニューロンがみられなかったが、深層ではみられた。(2)では、浅層でも標識ニューロンがみられた。このことから、短時間でもホルマリン固定をおこなった組織のほうが検出感度が高いことがわかった。RNA保護剤の検討RNA変性を遅らせることのできる市販のRNA保護剤、RNAlater-ICE (Ambion社)で組織を処理し、上記(2)の条件で免疫染色をおこなった。やや染色強度が低下したが、上記(2)同様の染色像がえられた。以上からRNA保護剤を用い、上記(2)の条件で免疫染色をおこなえばよいことがわかった。ホルマリン固定試料でRT-PCRをおこなうシステム(Arcturus社)と組み合わせることにより、確かな遺伝子情報が得られると考えられる。

Cy3 で directly identify し た 1 antibody を っ た short time immune dyeing で は, possibility of nonspecific staining の を negative し き れ ず, ま た, コ ス ト の surface も problem で あ っ た. Youdaoplaceholder0 で で, 従 <s:1> two-stage <s:1> immunohistochemistry で, high-sensitivity <s:1> antigen specificity <s:1> high <s:1>, short-time staining conditions を検 so た. ラ ッ ト big 脳 cortex を material と し, interface in ニ ュ ー ロ ン が hold つ カ ル ビ ン デ ィ ン た ん ぱ く (CB) の immunohistochemical を お こ な っ た. Normal seen で は, big 脳 の shallow cortex に は weak い CB immune dyeing, deep に は strong い immune dyeing を す interface indicated in ニ ュ ー ロ ン が distribution す る. Fixed method の is RNA preservation sex の よ い ア セ ト ン fixed (3) を shi し た organization ((1)) と, ホ ル マ リ ン fixed を ご く short time (1) between お こ な っ た organization ((2)) で compare し た. Youdaoplaceholder0 ずれ ずれ 10μm thick slices. Interfacial activity tonic お よ び normal ロ バ を serum containing む 燐 acid salt buffer salt chemical ナ ト リ ウ ム fluid (t - s - PBS) で, CB antibodies (ウ サ ギ immune グ ロ ブ リ ン) を 500 times when 釈 し, 1 (1) time お よ び (2) と anti 応 さ せ た. Buffer で, t - s - after PBS で at 100 times the bush 釈 し た Cy3 identity resistance ウ サ ギ immune グ ロ ブ リ ン antibody と 15 points between the 応 さ せ and examines 観 し た. (1) で は 1 big 脳 shallow cortex で は logo ニ ュ ー ロ ン が み ら れ な か っ た が, deep で は み ら れ た. (2)で で, shallow で で marking ニュ ニュ ロ ニュ がみられた がみられた. こ の こ と か ら, short time で も ホ ル マ リ ン fixed を お こ な っ た organization の ほ う が 検 out sensitivity high が い こ と が わ か っ た. RNA protection tonic の 検 for RNA - sex を 遅 ら せ る こ と の で き る city vendor の RNA protection tonic, RNAlater - ICE (Ambion) で organization を 処 し, written conditions (2) の で immune dyeing を お こ な っ た. The staining intensity of やや is が lower than that of たが. The same as in (2) above, the staining of <s:1> is like がえられた. The above <s:1> らRNA protectors を were used with った and the <s:1> conditions mentioned in (2) above で immunostaining をお なえばよ なえばよ とがわ とがわ とがわ った った. ホ ル マ リ ン fixed sample で rt-pcr を お こ な う シ ス テ ム (Arcturus club) と group み close わ せ る こ と に よ り, indeed か な heritage 伝 child intelligence が ら れ る と exam え ら れ る.