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ミトコンドリアエネルギー代謝抑制によるヒト臍帯血幹細胞より肝細胞への分化促進

抑制线粒体能量代谢促进人脐带血干细胞向肝细胞分化

基本信息

批准号：
17659215
负责人：
汐田剛史
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

1.DLST遺伝子ノツクダウンの最適化前年度DLST遺伝子に対するshRNAを発現プラスミド(pshDLST)を構築し、その機能を確認した。そこで、間葉系幹細胞E7において最も効率よくDLST遺伝子をノックダウンするための、プラスミドDNA導入方法の最適化を行った。その結果、FuGene6(Roche Aplied Science)3μL、プラスミドDNA1μLを混合し、6-wellプレートに2mLの培地で24時間導入反応を行うことにより、導入反応終了後48時間までDLST遺伝子mRNA発現が30%まで抑制されることを確認した。2.DLST遺伝子ノックダウンによる間葉系幹細胞におけるミトコンドリア電位の変化E7細胞に対してプラスミド導入反応(24時間)と培養(48時間)を1セットとし、これを3回繰り返した.すべての行程を終えた後、細胞内ミトコンドリアをローダミン(Rho)123により染色した.Rho123はミトコンドリア膜電位が脱分極方向に変化すると蛍光強度が上昇する。この結果、DLST遺伝子のノックダウンでは、有意な蛍光強度の変化は観察されなかった。3.DLST遺伝子ノックダウンによる間葉系幹細胞におけるアルブミン遺伝子発現の変化上記と同様のプロトコールに従い、各セット終了ごとにE7細胞mRNAを回収し、肝細胞のマーカー遺伝子であるアルブミン遺伝子の発現量をReal-Time RT-PCR法により定量した。このとき3セット終了までDLST遺伝子の発現抑制は確認された。その結果予想に反して、DLST遺伝子発現抑制によりアルブミンの発現量は70%まで有意に減少していることが明かとなった(3セット目終了時点においてのみ)。以上のことから、DLST遺伝子発現抑制単独では、間葉系幹細胞を分化するには不十分であることが明かとなった.おそらく分化誘導には、他に何らかのサイトカインの添加なども必要であったものと推測される。

1. The shRNA development strategy (pshDLST) of DLST gene was constructed and its function was confirmed before optimization of DLST gene. Optimization of DNA introduction methods for mesenchymal stem cells E7 The results showed that 3μL of FuGene6(Roche Aplied Science), 1μL of RAST DNA were mixed, 6-well culture was conducted in 2mL of culture medium for 24 hours, and DLST gene mRNA expression was 30% inhibited 48 hours after the introduction of RAST. 2. DLST gene transfer to mesenchymal stem cells for induction into reverse culture (24 hours) and culture (48 hours) for 3 cycles. At the end of the process, the intracellular membrane potential changes in the direction of polarization, and the intensity of light increases. The results of this study, DLST gene expression, and intentional light intensity changes were observed. 3. The expression of DLST gene in mesenchymal stem cells was quantified by Real-Time RT-PCR. 3. The occurrence and suppression of DLST gene is confirmed. As a result, the occurrence of DLST gene is expected to decrease by 70%. The occurrence of DLST gene is expected to decrease by 70%. The expression of DLST gene is inhibited by the differentiation of mesenchymal stem cells. It is necessary to add the following information: