新しい融合パートナーSPYMEGを用いるヒト抗血小板抗体産生ハイブドーマの作製

使用新的融合伙伴 SPYMEG 生成产生人抗血小板抗体的杂交瘤

• 批准号: 17659297
• 负责人: 山本 正雅
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Ohu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659297/
• 关键词: SPYMEG; モノクローナル抗体; インフルエンザ抗体; 血小板; GPIIb; IIIa複合体; ハイブリドーマ; 融合; IgG; パートナー細胞; ヒト抗体; 自己免疫疾患; 血小板減少性紫斑病; 前骨髄巨核芽球; MEG-01

フュージョンパートナー細胞SPYMEGを用いてヒトのモノクローナル抗体が作製できるか否かを検討した。健常人の末梢血よりリンパ球を得てSPYMEGとPEG法を用いて融合させ、HAT存在下にてハイブリドーマ細胞を培養した。融合細胞を768ウエルに播種したところ、コロニー形成率は平均28%(2回の融合)であった。IgG産生能をサンドイッチELISAにて測定した結果、コロニーが形成されたウエル中27%で陽性であった。これは既報のパートナー細胞Karpasを用いた成績に極めて近い値であった。ヒトのIgGを産生している細胞を限界希釈し単クローンにし、IgGを精製したところ、H-鎖、L-鎖ともに発現しており、完全なIgGが合成されていることが分った。抗体産生能はハイブリドーマに依存するがよく産生するクローンで2〜10μg/ml程度であった。ハイブリドーマはセルバンカーを用いて1ヶ月凍結保存し、その後再び培養を再開しても抗体産生能は凍結前に比べ変化はなかった。この結果から、かなり安定したヒトのモノクローナル抗体が作製できることが明らかになった。そこで、ヒトの特異的モノクローナル抗体を作製するために、ヒトに投与できる抗原としてインフルエンザワクチンを用いた。インフルエンザワクチン投与した場合、投与後1ヶ月以内に末梢血リンパ球を得てSPYMEGと融合させ、HAT存在下にてハイブリドーマ細胞を培養した。またインフルエンザに自然感染した健常人についても検討した。融合細胞を384ウエルに播種し、インフルエンザワクチン抗原AとBの混合液ををELISAプレートにコートし、スクリーニングを行なった。その結果、自然感染の健常人からのリンパ球を用いたときインフルエンザ抗原に陽性に反応するモノクローナル抗体が14クローンが陽性であり、最終的に2クローンが得られた。インフルエンザワクチンを投与したとき、121クローンが陽性であった。このうち最終的に12クローンが得られた。同手法を用いて、血小板のGPIIb/IIIa複合体に対する抗体を産生している自己免疫疾患患者から抗体の作製を行なった。その結果、2クローンが健常人の血小板に反応しIIb/IIIaを免疫沈降してくることがわかった。これらの結果から、SPYMEGはヒトのモノクローナル抗体の作製が可能でり、臨床と基礎医学研究に役立つと考えられた。

フ ュ ー ジ ョ ン パ ー ト ナ ー cells SPYMEG を with い て ヒ ト の モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody が cropping で き る か no か を beg し 検 た. The healthy human よ の peripheral blood り リ ン を パ ball て SPYMEG と を PEG method using い て fusion さ せ, presence of HAT に て ハ イ ブ リ ド ー マ cell を culture し た. The formation rate of fused cells を768ウエ ウエ に に seeding <s:1> たと ろ ろ and コロニ に was an average of 28%(2 times of <s:1> fusion)であった. IgG can produce を サ ン ド イ ッ チ ELISA に て determination し た results, コ ロ ニ ー が form さ れ た ウ エ ル 27% positive で で あ っ た. The <s:1> れ れ reports that the Karpasを of the <s:1> トナ トナ トナ トナ トナ を cells are に very めて close to the であった value であった. ヒ ト の IgG を produce し て い る cells を limit when 釈 し 単 ク ロ ー ン に し, IgG を refined し た と こ ろ, H - lock, L - lock と も に 発 now し て お り が synthesis, completely な IgG さ れ て い る こ と が points っ た. Antibody production can に ハ ブリド ブリド ブリド に に に dependent するがよく to produce する ロ ロ ロ <s:1> で で で で で で であった to a degree of 2-10μg/ml であった. ハ イ ブ リ ド ー マ は セ ル バ ン カ ー を with い て ヶ 1 month freezing preservation し, そ の び training again after open another し を て も antibodies can produce は before freezing に than べ variations change は な か っ た. こ の results か ら, か な り settle し た ヒ ト の モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody が cropping で き る こ と が Ming ら か に な っ た. そ こ で, ヒ ト の specific モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody を cropping す る た め に, ヒ ト に cast with で き る antigen と し て イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン を with い た. イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン cast with し た occasions, cast and リ に within ヶ 1 month after peripheral blood ン を パ ball て SPYMEG と fusion さ せ, HAT, the presence of に て ハ イ ブ リ ド ー マ cell を culture し た. ま た イ ン フ ル エ ン ザ に natural infection し た healthy normal に つ い て も beg し 検 た. Fused cells を 384 ウ エ ル に seeding し, イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン と B antigen の mixture を を ELISA プ レ ー ト に コ ー ト し, ス ク リ ー ニ ン グ を line な っ た. そ の results, natural infection の healthy normal か ら の リ ン パ を ball in い た と き イ ン フ ル エ ン ザ antigen positive に に anti 応 す る モ ノ ク ロ ー ナ が 14 ク ル antibody ロ ー ン が positive で あ り, final に 2 ク ロ ー ン が must ら れ た. イ ン フ ル エ ン ザ ワ ク チ ン を cast with し た と き, 121 ク ロ ー ン が positive で あ っ た. Youdaoplaceholder2 うち the final に12 ロ ロ が が が られた. With technique を い て, platelet の GPIIb/IIIa complex に す seaborne antibodies る を し て い る himself immune disorders か ら を line the antibody の cropping な っ た. そ の results, 2 ク ロ ー ン が healthy normal platelet に の anti 応 し IIb/IIIa を immune sink し て く る こ と が わ か っ た. こ れ ら の results か ら, SPYMEG は ヒ ト の モ ノ ク ロ ー ナ ル が may the antibody の cropping で り based medical research, clinical と に servants made つ と exam え ら れ た.

项目成果

融合パートナー細胞

融合伙伴细胞

• 发表时间: 2007