胚性幹細胞工学技術を用いた肺再生

利用胚胎干细胞工程技术进行肺再生

• 批准号: 17659432
• 负责人: 木本 誠
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17659432/
• 关键词: 発生・分化; 生体分子; 再生医学; 細胞・組織; 移植・再生医療; 肺胞; キトサン; 免疫染色; 胚性幹細胞; 三次元培養; 1型肺上皮細胞; 2型肺上皮細胞; 細胞分化

胚性幹(ES)細胞より肺胞への分化をin vitro、in vivoにて行った。1.ES細胞から胞への三次元培養による分化マウスES細胞をLIFを除いたES細胞培地にてスミロンセルタイト・スフェロイド96Uプレートにて5日間培養後、胚様体(EB)を作製し、キトサンスポンジ培養器の溝に入れて、7日間培養した。培養器の一側壁にはBMP-4,Wnt-7b, Shhを吸着させてあり、反対側壁にはFGF-7,FGF-10,Nogginを吸着させてある。その結果、スフェロイドの表面にI型肺上皮細胞のマーカーであるT1-α、Aquaporin-5が免疫染色で染色され、II型肺胞上皮細胞マーカーのSP-A、SP-C、TIF-1がスフェロイド内部に染色された。さらに、分化したスフェロイドの肺胞遺伝子発現を調べるためRT-PCRにてTiel, LAR-PTP2,T1-α、SP-Cを検出しえた。しかし、組織像においては肺胞様形態までにはいたらなかった。2.In vivoでの胞への分化ES細胞を同様にキトサンスポンジ培養器にて分化させた後、5-Carboxyfluorescein diacetate succinimidylester(CFDASE)にて生蛍光染色を行い、同系の129SVマウスの肺に注入した。移植後1,2週間目にて肺組織を摘出し、蛍光実体顕微鏡にて肺内の蛍光部位を確認後、凍結切片を作製し、細胞核はブルー蛍光DAPIにて発色した。CFDASEにてグリーン蛍光を発する細胞をT1-α、Aquaporin-5、SP-A、SP-C、TTF-1抗体にて免疫染色を施行した。'その結果、T1-α抗体に陽性に染色され、また軽度にAquaporin-5抗体に染色されたことより、I型肺胞上皮細胞に主に分化していたが、肺胞全体を形成するまでには至らなかったが、今後の発展が期待される。

Embryonic stem (ES) cells よ <s:1> pulmonary cells へ <s:1> differentiate をin vitro, in vivoにて rows った. 1. ES cells か ら cell へ の three yuan culture に よ る differentiation マ ウ ス ES cells を LIF を except い た ES cell culture to に て ス ミ ロ ン セ ル タ イ ト · ス フ ェ ロ イ ド 96 u プ レ ー ト に て 5 day after training, the embryo others body (EB) を as し, キ ト サ ン ス ポ ン ジ incubators の ditch に into れ て, 7 day training し た. Incubators の a sidewall に は BMP - 4, Wnt - 7 b, Shh を sorption さ せ て あ り, sidewall seaborne に は FGF - 7, FGF - 10, Noggin を sorption さ せ て あ る. そ の results, ス フ ェ ロ イ ド の surface に type I lung epithelial cells の マ ー カ ー で あ る T1 - alpha, Aquaporin 5 が immune dyeing で さ れ, type II lung epithelial cells of the cellular マ ー カ ー の SP - A, SP - C, TIF - 1 が ス フ ェ ロ イ ド internal に dyeing さ れ た. さ ら に, differentiation し た ス フ ェ ロ イ ド の lung cell heritage 伝 son 発 now を adjustable べ る た め rt-pcr に て Tiel, LAR - PTP2, T1 - alpha, SP - C を 検 out し え た. The たらな of the <s:1>, the tissue image にお the て て the pulmonary cell morphology までに the たらな the った った. 2.In vivoで <s:1> cells へ <e:1> differentiate ES cells を in the same way にキトサ <e:1> スポ ジ ジ incubators にて differentiate させた and then 5-Carboxyfluorescein diacetate Succinimidyl Lester (CFDASE)にて light 蛍 staining を row にて, homologous <s:1> 129SV ウス <s:1> lung に injection た た. 1, 2 weeks after transplantation between mesh に て を lung tissue extraction し, 蛍 light be 顕 micromirror に て in の lungs 蛍 light parts を confirmed, frozen section を cropping し, nucleus は ブ ル ー 蛍 light DAPI に て 発 color し た. CFDASE に て グ リ ー ン 蛍 light を 発 す る cells を T1 - alpha, Aquaporin - 5, SP - A, SP - C, the vera.ttf - 1 antibodies に て immune dyeing を imposed し た. 'そ の results, T1 - alpha antibody positive に に dyeing さ れ, ま た 軽 degrees に に Aquaporin - 5 antibody staining さ れ た こ と よ り, type I cell lung epithelial cells に main に し て い た が, lung cell all を す る ま で に は to ら な か っ た が, future の 発 exhibition が expect さ れ る.