ミトコンドリア機能を介する脳虚血耐性の分子化学的解明と麻酔薬作用に関する研究

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ハロタンで麻酔したラットより脳を摘出し,5mm四方の脳実質のブロックを作成した.作成した脳ブロックを,密閉チャンバー内でそれぞれの混合ガスに暴露した.高酸素(21%酸素+74%窒素+5%炭酸ガス)および無酸素(95%窒素+5%炭酸ガス)混合ガスを以下のように組み合わせた.Time control群(高酸素状態15分間),無酸素群(無酸素状態15分間),無酸素後高酸素群(無酸素5分後,続けて高酸素10分間),プレコンディショニング群(無酸素5分後,高酸素5分,続けて無酸素5分)とし,それぞれ正常,虚血,虚血後再還流,脳虚血耐性モデルとした.フリーラジカルアナライザー(APOLLO-4000,WPI社製)で,付属の酸素電極を用いて,脳細胞ミトコンドリアの呼吸機能を測定した.4つの電子伝達系の呼吸酵素複合体I, II, III, IVに対し,その阻害薬として,それぞれロテロン(1μM),マロン酸(10mM),アンチマイシンA(0.1μM),KCN(100μ紛を用い,ATP合成酵素阻害薬としてオリゴマイシンA(2μg/ml)を用いた.脳ブロックに対し,リン酸,コハク酸,アスコルビン酸,ADPを添加してそれぞれの反応を開始させた.現在まで,Time control群と無酸素群のみ行ったが,無酸素群ではこれらのミトコンドリア反応が抑制されることが明らかになった.一部の実験では,一酸化窒素合成酵素阻害薬L-NAME,ミトコンドリアATP感受性K+チャネル開口薬あるいは拮抗薬(ディアゾキサイドおよび5-HD)を用いて同様の実験を行う予定である.さらに,購入したフリーラジカルアナライザーで,一酸化窒素産生を測定し,正常,虚卑,虚血後再還流脳虚血耐性モデルでの一酸化窒素活性の変化を明らかにする予定である.