mRNAの生体内ラベル法を用いた嗅覚神経系回路形成を支配する新規遺伝子の同定

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本研究課題の目的は嗅覚神経細胞の軸索投射特異性を決定する分子機構と調節様式を明らかにする事である。この目的のため本研究はショウジョウバエを材料に軸索投射を制御する新規遺伝子群を同定する。その方法は以下の通りである。1)特定細胞内のmRNAのみを生体内でS(硫黄)ラベルできるUAS-uracil phosphoribosyltransferase (UPRT)遺伝子組換えバエを作成する。2)そのハエを用いて特定嗅覚神経細胞のmRNAのみを生体内でラベル、抽出する。3)抽出したmRNAを用いたDNAマイクロアレイ解析により遺伝子発現パターンを解析し、特定嗅覚神経細胞で特徴的に発現する遺伝子を同定する。平成19年度の進行状況は以下の通りである。mRNAを生体内でSラベル後、ラベルされたmRNAを効率よく抽出する事に成功した。その確認手順は以下の通りである。(1)羽成虫原基の前後軸に沿った細胞中で遺伝子発現を誘導するdpp-Gal4系統のハエをUAS-UPRT組換え体と交配し、その子供(G2)の3齢幼虫の羽成虫原基を取り出した。(2)G2羽成虫原基をUPRT酵素の基質である2,4-dithiouraci1を加えた培養液中で培養後、全RNAを抽出した。(3)全RNAのうちUPRT酵素によってSラベルされたRNAをさらにbiotin化後、streptavidin-affinity beadsを用いて精製した。抽出したラベルRNAは羽成虫原基の全mRNAより明らかに多量のdpp mRNAを含んでいた。今後は上記UAS-UPRT組換え体を特定嗅覚神経細胞でGAL4を発現するOr-Gal4系統と交配後、その子供の蛹の触角からRNAを抽出、DNAマイクロアレイ解析を行ない、特定嗅覚神経細胞で発現量が多い遺伝子を同定する予定である。