プレスチン結晶化の試み〜聴覚を鋭敏にしているモーター蛋白質の構造解明を目指して〜

尝试结晶prestin〜旨在阐明使听力敏感的运动蛋白的结构〜

• 批准号: 18659495
• 负责人: 和田 仁
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659495/
• 关键词: 分子モータ; 膜タンパク質; Prestin; 2次元結晶; 原子間力顕微鏡; 国際研究者交流; スイス

哺乳類の聴覚は内耳外有毛細胞の伸縮運動により鋭敏なものになっている.その伸縮運動の源は細胞側壁に高密度に発現しているタンパク質モータprestinの構造変化であると考えられている.Prestinについてその同定以来様々な研究が行われてきたが,prestinの形状や構造変化メカニズムは解明されていない.そこで本研究では,prestinの2次元結晶を作製し,その結晶を用いて,原子間力顕微鏡によるprestinの原子レベルでの可視化を目指した.本研究では,まず,これまでに構築したFLAGタグ融合型prestinを安定発現する細胞からprestinを精製した.精製したサンプルをSDS-PAGEで評価し,以降の実験に十分な純度まで精製できていることを確認した.また,細胞上のprestinの構造の安定性を検討した結果,サリチル酸ナトリウムが存在するとprestinの構造が安定することが明らかになった.これはprestinの結晶を作製する際にサリチル酸ナトリウムを添加すると良いことを示唆している.さらに,FLAGタグ融合型prestinを安定発現する細胞の細胞膜を単離し,細胞膜中のFLAGタグ融合型prestinをQ dotで標識した.そして,それを原子間力顕微鏡を用いて,Q dotを示す粒子の周辺の構造物の詳細な形状を観察した.その結果,prestinを示すと考えられる4つの突起を有し直径10nm前後の構造体を観察することが出来た.

Mammals have hair cells outside the inner ear that stretch and flex. The source of the stretching and contracting motion is the structural changes of the prestin substance found in the high density of the cell side walls. The same pattern of Prestin substance has been studied for a long time, and the shape and structural changes of prestin are clearly understood. In this study, the prestin of two-dimensional crystals was fabricated, and the crystals were visualized using atomic force microscopy. In this study, we constructed and purified a fused prestin. SDS-PAGE was used to determine the purity of the purified product. As a result, the stability of the prestin structure on the cell was investigated. In the case of prestin crystallization, it is necessary to add a good amount of water to the solution. In addition,FLAG fusion type prestin is stable in the cell membrane, and FLAG fusion type prestin in the cell membrane is identified by Q dot. For example, when atomic force microscopy is used,Q dot shows the detailed shape of the structure around the particle. As a result, the prestin was detected before and after the structure with a diameter of 10nm.

项目成果

Misfolding and mislocalization by mutations of the motor protein prestin

运动蛋白 prestin 突变导致的错误折叠和错误定位

• 发表时间: 2007
• 作者: 高野哲至;村松真臣;村上亮;並木亮;高橋義朗;Michio Murakoshi;熊野峻;熊野峻;熊野峻;熊野峻;熊野 峻
• 通讯作者: 熊野 峻

Immune Atomic Force Microscopy of the Plasma Membrane of Prestin-Transfected Chinese Hamster Ovary Cells Using Quantum Dots

使用量子点对 Prestin 转染的中国仓鼠卵巢细胞质膜进行免疫原子力显微镜检查

• 发表时间: 2008
• 作者: Manase K;Endo T;Chida M;Nagasawa K;Honnma H;Yamazaki K;Kitajima Y;Goto T;Kanaya M;Hayashi T;Mitaka T;Saito T.;Michio Murakoshi
• 通讯作者: Michio Murakoshi

Contribution of the GTSRH sequence to the folding of prestin: refolding of transport-defective prestin mutants by salicylate

GTSRH 序列对 prestin 折叠的贡献：水杨酸对运输缺陷 prestin 突变体的重折叠

• 发表时间: 2008
• 作者: M. Rashel;松崎 茂展;内山 淳平;前田 良浩;竹村 伊代;今井 章介;鳥飼源史;Izumi-Nagai K;Izumi-Nagai K;Yokoi M;Yokoi M;Jin XH;大野重昭;古館直樹;Jin X H;Suzuki Y;Jin XH;吉田和彦;Ohno S;Ohno S;嶋澤 雅光;嶋澤 雅光;嶋澤 雅光;Nakashima M;Sato D;Yoko Kitsunai;Hiroshi Wada;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;Michio Murakoshi;Toshihiro Matsui;Michio Murakoshi;Shun Kumano
• 通讯作者: Shun Kumano

Imaging by atomic force microscopy of the plasma membrane of prestin-transfected Chinese hamster ovary cells

• DOI: 10.1007/s10162-006-0041-z
• 发表时间: 2006-09-01
• 期刊: JARO-JOURNAL OF THE ASSOCIATION FOR RESEARCH IN OTOLARYNGOLOGY
• 影响因子: 2.4
• 作者: Murakoshi, Michio;Gomi, Takashi;Wada, Hiroshi
• 通讯作者: Wada, Hiroshi

Analysis of the Dynamic Behavior of the Inner Hair Cell Stereocilia by the Finite Element Method

• DOI: 10.1299/jsmec.49.828
• 发表时间: 2006-09
• 期刊: Jsme International Journal Series C-mechanical Systems Machine Elements and Manufacturing
• 作者: T. Matsui;C. Nakajima;Yui Yamamoto;M. Andoh;Koji Iida;M. Murakoshi;S. Kumano;H. Wada