权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

p53ホモ四量体形成ミュータントの探索-新規タンパク質間相互作用検出系の創出

寻找 p53 同四聚体形成突变体 - 创建新型蛋白质-蛋白质相互作用检测系统

基本信息

批准号：
19657037
负责人：
今川敏明
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657037/
关键词：
p53 四量体形成ドメイン無細胞タンパク質合成 cDNAライブラリー癌抑制タンパク質蛍光エネルギー移動ピューロマイシン蛍光融合タンパク質無細胞タンパク質合成系自己切断型リボザイム Puromycin タンパク質間相互作用 Two-hybrid Na K-ATPase

项目摘要

本年度研究計画1)p53四量体形成ドメイン変異体cDNAライブラリーの作製とスクリーニングに関して、ランダムオリゴプライマーを用いてMycタグ-p53四量体形成ドメインペプチド(p53TD)およびp53TD-HAタグをコードするcDNAライブラリーをPCR法によって作成し、それらを鋳型にin vitro transcriptionによってmRNAライブラリーを作製した。C-末端にHAタグを含むp53TDをコードするmRINAライブラリーについては、3'-末端にピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドをT4RNAリガーゼを用いて共有結合させた。これらmRNAライブラリーをHisタグ-野生型p53TDをコードするmRNAとともに、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で同時に翻訳し、合成されたペプチド混合液から、抗His抗体磁気ビーズを用いてHisタグ-野生型p53四量体形成ドメインペプチドと複合体を形成したペプチドを除去し、さらに抗Myc抗体磁気ビーズに結合しないペプチドを除去した。抗Myc抗体磁気ビーズに結合したMycタグ-p53TDペプチドと複合体を形成しているp53TD-HAペプチドのC-末端にピューロマイシンを介して付加しているmRNAを鋳型として、HAタグに対する特異的プライマーを用いて逆転写反応を行った。その後、p53TD-HA領域をコードするcDNAをPCRによって増幅し、His-野生型p53TDとは四量体を形成できないが、Myc-p53-TD変異体とは複合体を形成できるp53TD変異体ペプチドをコードするDNA配列を決定した。この過程を繰り返すことで、野生型p53とは四量体を形成できないが、変異体同士では四量体を形成できるホモ四量体形成p53変異体の候補配列を、数種類得ることができた。これら得られたp53TDドメインペプチド配列を含む全長p53と野生型p53との四量体形成能およびp53変異体の転写活性化能を検討するために、二種類の蛍光融合タンパク質p53間に起こる蛍光エネルギー移動によって四量体形成能を解析する実験系および生細胞を用いてp53の発現量と転写活性を同時にモニターできる実験系を構築した。

This year's research project 1)p53 tetrasomer formation, variant cDNA translation, gene expression, gene expression C-terminal HA contains p53TD, mRINA contains T4RNA, and 3'-terminal HA contains T4RNA. The expression of mRNA and protein in p53-wild-type p53 TDs was detected by PCR, and the expression of mRNA and protein in p53-wild-type p53 TDs was detected by PCR. The anti-Myc antibody magnetic binding complex was formed by PCR and the anti-Myc antibody magnetic binding complex was removed. Anti-Myc antibodies bind to Myc-p53 TD-protein complexes and form p53TD-HA-protein C-terminal protein complexes, which are mediated by mRNA typing and HA reverse transcription. The p53TD-HA domain cDNA PCR amplification, His-wild type p53TD and tetraploid formation, Myc-p53-TD heteroploid complex formation, p53TD heteroploid DNA alignment determination The process of p53 formation is different from that of wild-type p53. The process of p53 formation is different. The p53 gene was selected from the group consisting of the full-length p53 gene and the wild-type p53 gene, and the p53 gene was selected from the group consisting of the mutant p53 gene and the mutant p53 gene. Two kinds of light fusion between the p53, light production, movement, four-dimensional formation, analysis, and use of p53 production, writing activity, and construction of the system.