P型イオンポンプの無細胞タンパク質合成系を用いた発現法の開発と多量体形成機構

Na/K-ATPaseは、分子量約10万の触媒鎖(α鎖)と糖タンパク質のβ鎖からなる膜タンパク質で、本酵素の機能発現には、αβプロトマーからなるオリゴマー構造((αβ)_<2n>構造)の形成が非常に重要であることが明らかにされている。本研究では、タンパク質の発現をコントロールしやすい無細胞タンパク質合成系を用いることで、Na/K-ATPase合成過程におけるαβプロトマー形成やオリゴマー構造の構築を詳細に追跡することが可能になると考え、小麦胚芽抽出液を用いたタンパク質合成系によるNa/K-ATPaseの機能的発現系の確立を目指して研究を行った。昨年度の研究過程で作成したプラスミッドベクターを用いて、His-tag/Myc-tag/Flag-tagや蛍光タンパク質をN-末端に付加したNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質の合成を行った。合成反応後の試料をSDS-PAGEで解析したところ、CBB染色で合成が容易に検出できる量のα鎖・β鎖タンパク質を合成することができた。このタンパク質のみがN-末端のタグを認識する抗体と反応することから、非常に均一なタンパク質が合成できていることが明らかになった。しかし、α鎖・β鎖面タンパク質を同時に合成すると分子量の大きなα鎖の合成量が大きく減少した。また、膜分画を添加すると、混入するRNaseによるmRNAの分解を完全に阻害することが困難であることから、タンパク質の合成量は著しく減少した。合成されたNa/K-ATPaseを用いて、特異的阻害剤ウワバインで阻害可能なATP加水分解活性やATPase活性の部分反応の検出を試みたが、機能的発現を確認することはできなかった。また、N-末端のタグを認識する抗体を用いた共沈殿実験や蛍光エネルギー移動による、αβ複合体の形成についても検討したが、α鎖・β鎖間相互作用を示唆する結果を得ることはできなかった。

Na/K-ATPaseは、分子量約10万の触媒鎖(α鎖)と糖タンパク質のβ鎖からなる膜タンパク質で、本酵素の機能発現には、αβプロトマーからなるオリゴマー構造((αβ)_<2n>構造)の形成が非常に重要であることが明らかにされている。本研究では、タンパク質の発現をコントロールしやすい無細胞タンパク質合成系を用いることで、Na/K-ATPase合成過程におけるαβプロトマー形成やオリゴマー構造の構築を詳細に追跡することが可能になると考え、小麦胚芽抽出液を用いたタンパク質合成系によるNa/K-ATPaseの機能的発現系の確立を目指して研究を行った。昨年度の研究過程で作成したプラスミッドベクターを用いて、His-tag/Myc-tag/Flag-tagや蛍光タンパク質をN-末端に付加したNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質の合成を行った。合成反応後の試料をSDS-PAGEで解析したところ、CBB染色で合成が容易に検出できる量のα鎖・β鎖タンパク質を合成することができた。このタンパク質のみがN-末端のタグを認識する抗体と反応することから、非常に均一なタンパク質が合成できていることが明らかになった。しかし、α鎖・β鎖面タンパク質を同時に合成すると分子量の大きなα鎖の合成量が大きく減少した。また、膜分画を添加すると、混入するRNaseによるmRNAの分解を完全に阻害することが困難であることから、タンパク質の合成量は著しく減少した。合成されたNa/K-ATPaseを用いて、特異的阻害剤ウワバインで阻害可能なATP加水分解活性やATPase活性の部分反応の検出を試みたが、機能的発現を確認することはできなかった。また、N-末端のタグを認識する抗体を用いた共沈殿実験や蛍光エネルギー移動による、αβ複合体の形成についても検討したが、α鎖・β鎖間相互作用を示唆する結果を得ることはできなかった。