限定されたアミノ酸からなるランダム配列タンパク質の機能探索

由有限氨基酸组成的随机序列蛋白质的功能探索

基本信息

批准号：
19657073
负责人：
土居信英
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、独自の試験管内選択技術であるin vitro virus (IVV)法を用いて、「原始的」アミノ酸を含む、限定された数種類のアミノ酸からなる大規模なランダム配列タンパク質ライブラリーを構築し、その中から機能や構造をもつ配列の探索を行う。これにより、タンパク質や遺伝暗号の初期進化の可能性に関する「実験進化学」的アプローチを試みるとともに、「20種類よりも少ないアミノ酸からなる限定された配列空間を探索する」というアイデアが、新しい機能タンパク質の効率的な探索法として有効か否か検証することを目的とする。ランダム配列として、コドンの2文字目と3文字目の塩基をN(4種類の塩基の混合)とし、コドンの1文字目の塩基をGまたはAに限定した合成DNAを用いて、12種類のアミノ酸からなるランダム配列を設計した。コントロールとして、コドンの1文字目の塩基もNとした20種類すべてのアミノ酸からなるランダム配列も準備した。SH3ドメインの約半分をこれらのランダム配列で置換したライブラリーをそれぞれ作製し、SH3ドメインの基質ペプチドへの結合能を指標として試験管内選択を行った。その結果、アミノ酸の種類を限定した場合と20種類すべてを用いた場合とで、いずれもスクリーニングの3ラウンド目で結合能をもつ配列の濃縮が確認されたことから、2つのライブラリーはアミノ酸の種類に関わらずほぼ同程度の機能配列を含んでいることが示唆された。現在、得られたタンパク質を大量発現・精製して、アミノ酸の種類によって結合能以外の物性に違いがあるか詳細に検討中である。

在这项研究中，我们使用体外病毒（IVV）（一种独特的体外选择技术，以及使用功能和结构的序列搜索序列，构建了由有限数量的氨基酸（包括“原始”氨基酸）组成的大规模随机序列蛋白库。这旨在尝试采用“实验进化”方法来实现蛋白质和遗传代码的早期进化的可能性，并验证“搜索由少于20种氨基酸组成的有限序列空间”的想法是否有效，是一种有效的方法，可以搜索寻找新功能蛋白的有效方法。作为一个随机序列，使用合成DNA设计了由12种类型的氨基酸组成的随机序列，其中密码子的第二和第三个特征的碱基的基础是n（四种类型的碱基的混合物），而密码子的第一个字符的碱基限制为G或A。作为对照组，由所有20个氨基酸组成的随机序列，也是第一个氨基酸的随机序列。准备了大约一半的SH3结构域的文库，以这些随机序列代替这些随机序列，并使用SH3域与底物肽作为指示器结合的能力进行体外选择。结果，在有限的氨基酸类型和所有20种类型的使用之间，在第三轮筛选中证实了具有结合能力的序列的富集，这表明这两个文库都包含几乎相同的功能序列，而与氨基酸类型无关。当前，大量获得的蛋白质被表达和纯化，并且详细介绍了根据氨基酸类型，除了结合能力外是否存在差异。