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進化分子工学によるエストロゲン様物質センサータンパク質の創出

通过进化分子工程创建类雌激素物质传感器蛋白

基本信息

批准号：
13760236
负责人：
土居信英
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760236/
关键词：
進化分子工学タンパク質工学遺伝子工学バイオセンサー

项目摘要

本年度は,エストロゲンレセプターの分子結合部位を含むドメインをアルカリホスファターゼに挿入した融合タンパク質の機能・構造解析を行った.それらの遺伝子にランダム変異を導入し,エストロゲン様物質に対するセンサータンパク質のスクリーニングを行った.(1)挿入型融合タンパク質の発現・精製および機能・構造解析前年度に構築した10種類の挿入型融合タンパク質,すなわち,アルカリホスファターゼの立体構造上表面に位置する5つの部位(アミノ酸残基番号:189,250,315,360,408)に,2ないし11アミノ酸残基の2通りのリンカーを介して,エストロゲンレセプターを挿入したタンパク質を,それぞれ大腸菌内で発現したところ,すべて不溶性画分に存在した.それらを変性条件下で精製し巻き戻したタンパク質について,エストラジオール存在下および非存在下でホスファターゼ活性を測定したところ,すべて活性は検出できなかった.それらの円二色性測定を行ったところ,二次構造含量がかなり低下していたことから,タンパク質の巻き戻しが不十分であることが示唆された.(2)センサータンパク質のスクリーニングそこで,上記10種類の融合タンパク質にランダム変異を導入して,前年度に用意した,PVDF膜を用いたスクリーニング系を用いて,エストラジオール存在下でホスファターゼ活性を示すコロニーのスクリーニングを試みた.ランダム点変異の導入は,Error-prone PCR法で行った.このPCR産物を制限酵素で消化してベクターに連結し,挿入型融合タンパク質の変異体遺伝子ライブラリーを作製した.このライブラリーを大腸菌に導入したコロニーをPVDF膜に転写し,ホスファターゼ活性を示すコロニーをスクリーニングした.しかし,選択されたコロニーの活性は宿主由来のものばかりで,目的の変異体を得ることはできなかった.現在,スクリーニング系の改良を行っている.

This year's エストロゲンレセプターのmolecule binding site をcontaining むドメインをアルカリホスファターゼにINSERT したFUSION タンパクqualityのFUNCTIONAL STRUCTURE ANALYSISを行った.それらの缝子にランダム変differentを Importし,エストロゲン様Matterに対するセンサータンパク性のスクリーニングを行った. (1) Insert-type fused タンパクquality の発 appear, refined および function, structural analysis the year before last 10 kinds of built-in insert type fusion タンパク性,すなわち,アルカリホスファターゼThe upper surface of the three-dimensional structure is located at the 5-point site (amino acid residue number: 189, 250, 31 5,360,408)に,2ないし11アミノacid residueの2通りのリンカーを开して,エストロゲンレセプターをINSERT したタンパク性を, それぞれ coliform internal で発 appear したところ, the existence of the insoluble draw points of the すべて.について, エストラジオール in the presence of および in the absence of でホスファターゼactivity measurementしたところ,すべてActivityは検出できなかった.それらの円Dichroism determinationを行ったところ,二The secondary structure content is low, the quality is low, and the quality is not very high. (2) センサータンパク性のスクリーニングそこで, the 10 types mentioned above Fusion of タンパクquality にランダム変differentをimportして, previous year's intention した, PVDF membrane をいたスクリーニングを用いて, エストラジオールでホスファターゼACTIVE をshowすコロニーのスクリーニングをtrialみた.ランダム点変differentの Importは,Error-prone The PCR method is used. The PCR product is digested with restriction enzymes and connected, and the quality of the insertion type fusion is different. The body's body is produced by the body.ホスファターゼACTIVE SYSTEMした.しかし, the origin of the selected host of されたコロニーのActivityのものばかりで, the purpose of の変variant をget ることはできなかった.Now, スクリーニング Department of の Improved を行っている.