進化分子工学によるエストロゲン様物質センサータンパク質の創出

通过进化分子工程创建类雌激素物质传感器蛋白

• 批准号: 13760236
• 负责人: 土居 信英
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760236/
• 关键词: 進化分子工学; タンパク質工学; 遺伝子工学; バイオセンサー

本年度は,エストロゲンレセプターの分子結合部位を含むドメインをアルカリホスファターゼに挿入した融合タンパク質の機能・構造解析を行った.それらの遺伝子にランダム変異を導入し,エストロゲン様物質に対するセンサータンパク質のスクリーニングを行った.(1)挿入型融合タンパク質の発現・精製および機能・構造解析前年度に構築した10種類の挿入型融合タンパク質,すなわち,アルカリホスファターゼの立体構造上表面に位置する5つの部位(アミノ酸残基番号:189,250,315,360,408)に,2ないし11アミノ酸残基の2通りのリンカーを介して,エストロゲンレセプターを挿入したタンパク質を,それぞれ大腸菌内で発現したところ,すべて不溶性画分に存在した.それらを変性条件下で精製し巻き戻したタンパク質について,エストラジオール存在下および非存在下でホスファターゼ活性を測定したところ,すべて活性は検出できなかった.それらの円二色性測定を行ったところ,二次構造含量がかなり低下していたことから,タンパク質の巻き戻しが不十分であることが示唆された.(2)センサータンパク質のスクリーニングそこで,上記10種類の融合タンパク質にランダム変異を導入して,前年度に用意した,PVDF膜を用いたスクリーニング系を用いて,エストラジオール存在下でホスファターゼ活性を示すコロニーのスクリーニングを試みた.ランダム点変異の導入は,Error-prone PCR法で行った.このPCR産物を制限酵素で消化してベクターに連結し,挿入型融合タンパク質の変異体遺伝子ライブラリーを作製した.このライブラリーを大腸菌に導入したコロニーをPVDF膜に転写し,ホスファターゼ活性を示すコロニーをスクリーニングした.しかし,選択されたコロニーの活性は宿主由来のものばかりで,目的の変異体を得ることはできなかった.現在,スクリーニング系の改良を行っている.

This year, it is possible to create an analytical database for the combination of the molecules in the combination part of the molecule that contains the fusion molecule. In order to improve the performance of the system, we need to know how to improve the performance of the system. (1) in the current year, the performance of the system has been improved. (1) in the previous year, the performance of the system has been improved. The position of the upper surface (no. 189250315360408), the acid residue (no.: 189250315360408), the acid residue, the acid residues, the acid residues, the acid residues, In the presence of non-existent conditions, the activity is measured in the presence of non-existent conditions. To determine the dichroism of dichroism, the content was measured twice, and the content was lower than that in the previous year. (2) the dichroism test showed that the dichroism test was effective in the determination of dichroism. (2) the determination of dichroism in the dichroism test, the determination of dichroism, the determination of dichroism. The PVDF membrane is used to measure the activity of the membrane in the presence of the device. In this paper, the Error-prone PCR method is used. The restriction enzyme is digested, the enzyme is digested, the enzyme is linked, and the fusion is made into the body. The PVDF membrane was inscribed by the fungus, and the activity was shown by the activity. In this case, select the origin of the active host, and the purpose of the host is to get the host. At present, it is necessary to improve the quality of the economy.

项目成果

土居信英, 柳川弘志: "Genotype-phenotype linkage for directed evolution and screening of combinatorial protein libraries"Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 4,6. 497-509 (2001)

Nobuhide Doi、Hiroshi Yanakawa：“用于组合蛋白质库的定向进化和筛选的基因型-表型联系”组合化学与高通量筛选4,6 (2001)。

土居信英, 高嶋秀昭 他: "Novel fluorescence labeling and high-throughput assay technologies for in vitro analysis of protein interactions"Genome Research. 12・3. 487-492 (2002)

Nobuhide Doi、Hideaki Takashima 等：“蛋白质相互作用体外分析的新型荧光标记和高通量测定技术”12・3（2002 年）。

土居信英, 柳川弘志: "タンパク質の試験管内進化のための遺伝子型と表現型の対応づけ"生物物理. 41,3. 147-151 (2001)

Nobuhide Doi，Hiroshi Yanakawa：“蛋白质体外进化的基因型-表型对应关系”生物物理学 41,3（2001）。

土居信英, 柳川弘志: "Evolutionary design of generic GFP biosensors"Methods in Molecular Biology. (印刷中). (2002)

Nobuhide Doi，Hiroshi Yanakawa：“通用 GFP 生物传感器的进化设计”分子生物学方法（2002 年出版）。

土居信英, 柳川弘志 他: "コンビナトリアル・バイオエンジニアリング"化学同人. 213 (2003)

Nobuhide Doi、Hiroshi Yanakawa 等人：《组合生物工程》化学同人志 213 (2003)。