活性毒素フラグメント[A]を用いた破傷風毒素の神経伝達阻害作用の分子機構解明

利用活性毒素片段阐明破伤风毒素神经传递抑制作用的分子机制[A]

• 批准号: 04454195
• 负责人: 松田 守弘
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 1993
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04454195/
• 关键词: 破傷風毒素; 毒素フラグメント; 細胞内局在; 開口分泌; クロマフィン細胞; プロティンキナーゼC; カルモデュリン; テタノリジン; 神経伝達物質; 副腎クロマフィン細胞; C-キナーゼ

ジギトニンで透過性にしたウシ副腎クロマフィン細胞ノルエピネフリン(NE)開口分泌系で破傷風毒素、毒素フラグメント[A](L鎖)が内在性NE放出をも殆ど完全に阻害することを示し、中毒細胞の細胞情報伝達過程の変化を毒素の標的物質と見なされている細胞内情報物質や開口分泌に関与が推定されているCa^<2+>結合蛋白質との関連において調べ、cGMP,cGMP特異的ホスホジエステラーゼ、ANF依存性グアニレートシクラーゼ、C-キナーゼと毒作用との関係をはっきりと否定した。またcAMP,A-キナーゼやカルモデュリンと本毒素の作用点とは直接関係がないことを示した。その際、開口分泌にカルモデュリンが関与していることを直接示すことができ、ミオシン軽鎖を介する経路の関与を示し、C-キナーゼがmodulatorとして働いていることを明らかにした。中毒細胞の蛋白質リン酸化を本毒素が変化させないことを示した。中毒細胞における毒素結合物質の局在やその細胞骨格との関係を電顕的および抗L鎖抗体を用いて免疫組織化学的に調べ、透過性細胞は形質膜に損傷がみられるがCa^<2+>依存性NE放出機構はよく保たれ、毒素による阻害で開口分泌像がみられなくなり、開口分泌に伴うアクチンの細胞辺縁での断裂凝集化もなくなる結果を得た。二重蛍光染色の結果、毒素は分泌顆粒にほぼ一致して局在し、アクチンやカルパクチンIとは異なる分布をしていた。L鎖のin vitroでのZn依存性蛋白質分解活性がシナプス小胞膜随伴シナプトブレビン2を特異的基質とすることを確かめた。静注によるin vivo毒性はZnを除去した標品でも差がなかった。L鎖はin vitroでのカルパクチンI依存性分泌顆粒凝集系やCa^<2+>ホスホリパーゼA_2依存性膜融合系に影響を及ぼさなかった。従って破傷風毒素の作用点は、これらの物質の作用点と直接関係しない。テタノリジンを高度に精製して、その大きな孔形成特性を明らかにし、新しい高分子物質透過性開口分泌系を開発した。

Permeability に ジ ギ ト ニ ン で し た ウ シ adrenal ク ロ マ フ ィ ン cells ノ ル エ ピ ネ フ リ ン (NE) opening secretion で tetanus toxin and toxin フ ラ グ メ ン ト [A] (L) が internality NE release を も perilous ど completely に resistance against す る こ と を し, poisoning cells の intelligence の 伝 of process variations change material と see な を toxin の mark さ れ て い る Intelligence material in the cell secretion や openings に masato and presumption が さ れ て い る Ca ^ 2 + > < binding protein と の masato even に お い て べ, cGMP, cGMP specific ホ ス ホ ジ エ ス テ ラ ー ゼ, ANF dependability グ ア ニ レ ー ト シ ク ラ ー ゼ, C - キ ナ ー ゼ と poison effect と の masato is を は っ き り と negative し た. ま た cAMP, A - キ ナ ー ゼ や カ ル モ デ ュ リ ン と this toxin の point と は masato is directly が な い こ と を shown し た. そ の interstate, opening secretion に カ ル モ デ ュ リ ン が masato and し て い る こ と を directly shown す こ と が で き, ミ オ シ ン 軽 lock を interface す る 経 road の masato and を し, C - キ ナ ー ゼ が modulator と し て 働 い て い る こ と を Ming ら か に し た. The <s:1> protein of the poisoned cells is リ <s:1> acidified を. This toxin is が transformed させな とを とを とを. Poisoning cells に お け る toxin combining material の bureau in や そ の cells bone と の masato is を electric 顕 お よ び L lock antibody を resistance with い て immunohistochemical に べ, through sex cells は form plasma membrane に damage が み ら れ る が Ca ^ 2 + > < dependency NE release agency は よ く bartender た れ, toxin に よ る secretion resistance against で openings like が み ら れ な く な り and openings Secretion of に accompanied by うア チ チ <s:1> <s:1> cells 辺 omn で <s:1> rupture agglutination なくなる なくなる result of を た た. Double 蛍 の light dyeing results, toxin は secretory granules に ほ ぼ consistent し て bureau in し, ア ク チ ン や カ ル パ ク チ ン I と は different な る distribution を し て い た. L lock の in vitro で の zinc dependence protein decomposition activity が シ ナ プ ス membrane with the companion シ ナ プ ト ブ レ ビ ン 2 を specific substrate と す る こ と を か indeed め た. Intravenous injection of によるin vivo toxicity による Znを removal of <s:1> た standard で で difference がな った った った. L lock は in vitro で の カ ル パ ク チ ン I dependence secretory granules agglutinate series や Ca ^ 2 + > < ホ ス ホ リ パ ー ゼ A_2 dependency に influence を and membrane fusion ぼ さ な か っ た. The <s:1> action site of 従って tetanus toxin 従って and the と れら action site of <s:1> substance と are directly related to <s:1> な な. テ タ ノ リ ジ ン を highly に refined し て, そ の big き な hole formation features を Ming ら か に し, new し い polymer substances through sexual secretion of opening を open 発 し た.

项目成果

T.Senda,T.Okabe,M.Matsuda and H.Fujita: "Quick-freeze,deep-etch visualization of exocytosis in anterior pituitary secretory cells:localization and possible roles of actin and annexin II." Cell Tissue Res.275(in press). (1994)

T.Senda、T.Okabe、M.Matsuda 和 H.Fujita：“垂体前叶分泌细胞胞吐作用的快速冷冻、深蚀刻可视化：肌动蛋白和膜联蛋白 II 的定位和可能的作用。”

松田 守弘: "破傷風神経毒素の構造・作用と破傷風の病態生理" 日本医事新報. 3545. 180-181 (1992)

Morihiro Matsuda：“破伤风神经毒素的结构和作用以及破伤风的病理生理学”日本医学新报 3545. 180-181 (1992)

M.Matsuda, T.Okabe and N.Sugimto: "Tetanus neurotoxin:(1) Immunological roles of fragments of the toxin in protection, and (2) attempts to identify target site(s) of its toxic action" Plenum Publishing Corp,New York. (ed. B.R.DasGupta), . 273-286 (1993)

M.Matsuda、T.Okabe 和 N.Sugimto：“破伤风神经毒素：(1) 毒素片段在保护中的免疫学作用，以及 (2) 尝试识别其毒性作用的靶位点”Plenum Publishing Corp，

M.Matsuda,T.Okabe,N.Sugimoto,T.Senda and H.Fujita: "Tetanus toxin and Clostridium perfringens enterotoxin as tools for the study of exocytosis." Ann.N.Y.Acad.Sci.710. 94-106 (1994)

M.Matsuda、T.Okabe、N.Sugimoto、T.Senda 和 H.Fujita：“破伤风毒素和产气荚膜梭菌肠毒素作为研究胞吐作用的工具。”

M.Matsuda, M.Kamei, M.Sigimoto, Y.Ma and S.Hashizume: "Anti-tetanus human monoclonal antibodies with high protective activity" The Venom and Toxin Research Group,National University of Singapore (eds. P. Gopalakrishnakone, C.K. Ten), . 349-354 (1992)

M.Matsuda、M.Kamei、M.Sigimoto、Y.Ma 和 S.Hashizume：“具有高保护活性的抗破伤风人单克隆抗体”新加坡国立大学毒液和毒素研究小组（编辑 P. Gopalakrishnakone，