酵母における生物時計の遺伝学的,分子生物学的解析

酵母生物钟的遗传和分子生物学分析

基本信息

批准号：
05454628
负责人：
劔邦夫
金额：
$ 4.35万
依托单位：
山梨医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至 1995
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は,出芽酵母よりショウジョウバエの時計遺伝子perとかなり広い範囲で相同性を示す遺伝子GTS1をクローン化した.そして,遺伝子操作でGTS1遺伝子欠損株、多コピー遺伝子導入株を作成し表現型を調べたところ,出芽時間,および細胞サイズが遺伝子数,および転写産物量(Gts1タンパク質)に依存的に変化することを認めた.さらに最近,(1)これまで酵母,ハエなどで時計遺伝子の表現型として知られている,熱抵抗性,胞子形成,寿命などで,Gts1が関与しているかをしらべたところ,それぞれにおいて,Gts1タンパクの発現量にほぼ比例した効果が見られることがわかった.また,多量発現させた場合,凝集反応が起こることが解った.(2)Gts1タンパク質がリン酸化タンパク質であり,セリン残基にリン酸化されていること,ヒドロキシウレアなどで細胞周期を停止すると脱リン酸化型が消え,すべてリン酸化型に移行するとをみとめた.現在,Gts1タンパクを多量発生させて,精製し,リン酸化サイトの同定をおこなっている.(3)two-hybrid法でGts1タンパクが細胞内でホモダイマーとして機能していることを見い出し,ホモダイマー形成にややカルボキシ末端側の20残基の部位が関与しており,その中のアスパラギン酸が重要であることが解った.(4)Gts1と結合するタンパク質の検索をtwo-hybrid法でおこない,いくつかの候補タンパク質を同定した.また,ホモダイマー形成部位と相同性をもつ多剤抵抗性トランスポーターと結合することが解り,その意義を検討中である .

我们克隆了GTS1，该基因比出现的酵母在相当广泛的果蝇时钟基因中表现出同源性。然后，我们通过基因工程构建了GTS1基因缺陷菌株和多拷贝转基因转染菌株并检查了表型，发现萌芽时间和细胞大小根据基因的数量和转录本的数量（GTS1蛋白质）而变化。此外，当我们研究GTS1是否参与热度，孢子形成，寿命等（酵母和果蝇中的时钟基因表型）时，我们发现效应与每种情况下的效果与GTS1蛋白的表达水平大致成比例。此外，当我们研究GTS1的表型时，发现大量表达时，会发生凝集反应。（2）GTS1蛋白是一种磷酸化的蛋白质，发现它被磷酸化为丝氨酸残基，并且当细胞周期用羟基脲停止时，去磷酸化的形式就会消失，并且所有蛋白质都会转移到磷酸化的形式中。当前，生成，纯化的大量GTS1蛋白，并鉴定出磷酸化的位点。（3）两种杂交方法发现GTS1蛋白在细胞中起均匀二聚体的作用，并且羧基末端20个残基的位点与同二聚体形成有关，而天冬氨酸很重要。（4）使用两种杂交方法对与GTS1结合的蛋白质进行搜索，并鉴定了几种候选蛋白。还发现它与具有同型二聚体形成位点同源性的多药耐药转运蛋白结合，并且正在考虑其重要性。。