オステオポンチンの機能と発現機序の解析

1.リコンビナントオステオポンチン(rOP)の分離と細胞接着および移動における意義の解析:a)rOPの分離:大腸菌系ベクターを用いてヒト、マウスおよびウサギのrOPを発現させ、HPLCで精製した。さらに、GRGDSをGRGESに変異させたrOPも分離した。b).rOPによる細胞の接着およびハプトタキシス(HT)実験:ヒトおよびウサギrOPの発現分離が効果的に行われた。これらを用いてrOPにマクロファージ(Mphi)細胞株に対する強い接着能があることを確認した。GRGES蛋白では接着作用は認められなかった。また、rOPで処理したMphiのフィブロネクチン(FN)による接着作用は阻止された。しかし、GRGES蛋白では阻止されなかった。rOPに対するポリクローン抗体を作成し、この抗体によりrOPの接着およびHT活性が完全に抑制されることを観察した。rOPにHT活性が見られた。FNのHT作用はrOPで阻止されず、また、この逆も同様であった。rOPはケモタキシス作用を示さなかった。c).rOPのマウスメラノーマB16細胞転移への影響:rOPとB16細胞を静注することにより0.1-0.5mug/マウスの低濃度でも強くB16細胞の肺転移を抑制することを観察した。d).OPトランスジェニックマウス(TM)作成:メタロチオネイン(MT)プロモーターを連結したマウスOP遺伝子をC57BL/6Nマウス卵に注入しTGを作成した。現在複数のTGを親として仔の生産を試みている。しかし、喰仔が高頻度に起こるため、2世代目の仔を確認するに至っていない。2.OP遺伝子の発現機序解析:a).クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)アッセイ:ヒトOP遺伝子のプロモーター領域(-1206bp)のCATクローンを作成し、-124および-94以下の領域を含むCATクローン(124CATおよび94CAT)にMphi細胞株できわめて強力な活性を検出した。この活性はOP発現が見られないRaji細胞では認められなかった。124CATには既知のE4TF1配列が存在したが、94CATには既知のシス配列は存在しなかった。124CATと94CATの間の配列を含むクローンではいずれもCAT活性はみられないことおよび124CATの活性は94CATより低いことから、E4TF1は94CATに存在する活性を回復させるにとどまり、重要な配列は94CATに存在すると思われた。また、-79以下を含むクローンではCAT活性が見られないため-94--79間に活性配列が存在すると思われた。b).ゲルシフト(GS)アッセイ:-124--70間を数区間に区切りそのDNAを合成し、GSおよび競合アッセイを行った。それにより-88--83の(G)AAAACにユニークな核蛋白が結合することを確認した。Gを除くこの配列はマウスやブタOPの配列にも存在し、この配列がOPの発現に重要であることが示唆された。

1.リコンビナントオステオポンチン(rOP)の分離と細胞接着および移動における意義の解析:a)rOPの分離:大腸菌系ベクターを用いてヒト、マウスおよびウサギのrOPを発現させ、HPLCで精製した。さらに、GRGDSをGRGESに変異させたrOPも分離した。b).rOPによる細胞の接着およびハプトタキシス(HT)実験:ヒトおよびウサギrOPの発現分離が効果的に行われた。これらを用いてrOPにマクロファージ(Mphi)細胞株に対する強い接着能があることを確認した。GRGES蛋白では接着作用は認められなかった。また、rOPで処理したMphiのフィブロネクチン(FN)による接着作用は阻止された。しかし、GRGES蛋白では阻止されなかった。rOPに対するポリクローン抗体を作成し、この抗体によりrOPの接着およびHT活性が完全に抑制されることを観察した。rOPにHT活性が見られた。FNのHT作用はrOPで阻止されず、また、この逆も同様であった。rOPはケモタキシス作用を示さなかった。c).rOPのマウスメラノーマB16細胞転移への影響:rOPとB16細胞を静注することにより0.1-0.5mug/マウスの低濃度でも強くB16細胞の肺転移を抑制することを観察した。d).OPトランスジェニックマウス(TM)作成:メタロチオネイン(MT)プロモーターを連結したマウスOP遺伝子をC57BL/6Nマウス卵に注入しTGを作成した。現在複数のTGを親として仔の生産を試みている。しかし、喰仔が高頻度に起こるため、2世代目の仔を確認するに至っていない。2.OP遺伝子の発現機序解析:a).クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)アッセイ:ヒトOP遺伝子のプロモーター領域(-1206bp)のCATクローンを作成し、-124および-94以下の領域を含むCATクローン(124CATおよび94CAT)にMphi細胞株できわめて強力な活性を検出した。この活性はOP発現が見られないRaji細胞では認められなかった。124CATには既知のE4TF1配列が存在したが、94CATには既知のシス配列は存在しなかった。124CATと94CATの間の配列を含むクローンではいずれもCAT活性はみられないことおよび124CATの活性は94CATより低いことから、E4TF1は94CATに存在する活性を回復させるにとどまり、重要な配列は94CATに存在すると思われた。また、-79以下を含むクローンではCAT活性が見られないため-94--79間に活性配列が存在すると思われた。b).ゲルシフト(GS)アッセイ:-124--70間を数区間に区切りそのDNAを合成し、GSおよび競合アッセイを行った。それにより-88--83の(G)AAAACにユニークな核蛋白が結合することを確認した。Gを除くこの配列はマウスやブタOPの配列にも存在し、この配列がOPの発現に重要であることが示唆された。