遺伝子導入法による小胞体の形態形成機構の解析

基因转移法分析内质网形态发生机制

• 批准号: 05680622
• 负责人: 山本 章嗣
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05680622/
• 关键词: 小胞体; 遺伝子導入; COS細胞; ミクロソ-ム型アルデヒド脱水素酵素; ALDH; 免疫電顕法

私達は、COS細胞に小胞体膜蛋白質であるラット肝ミクロゾ-ム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)を遺伝子導入法により発現させると、多数の管状小胞体が規則正しく配列した結晶体様小胞体が細胞内に出現することを見い出し、その形成機構を解析した。遺伝子導入したCOS細胞を蛍光抗体法、免疫電顕法を用いて2重染色し、msALDHと内在性の小胞体蛋白であるプロリン水酸化酵素の局在を解析した。その結果、野生型msALDHを発現したCOS細胞では結晶体様小胞体がおもに核周囲に形成され、msALDHは結晶体様小胞体の膜上に、プロリン水酸化酵素はその内腔に存在することが明らかになった。次に、msALDHの部分欠失変異体あるいはクロラムファニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ(CAT)とmsALDHとのキメラ蛋白をCOS細胞に発現させることによって、結晶体様小胞体の形成機構の解析を試みた。msALDHのC末端の疎水的領域(C末アンカ-部位)を欠くため小胞体膜へ移行できないmsALDHの変異体では結晶体様小胞体の出現は見られなかった。CATのC末にmsALDHのC末35残基を結合させたキメラ蛋白は小胞体に局在するにもかかわらず、結晶体様小胞体は現われなかった。以上の事実は、結晶様小胞体の形成には、msALDHが小胞体膜に挿入されることが必要であること、サイトゾル側に位置するN末側部分も重要であることを示している。小胞体上に多数発現したmsALDH分子を介して小胞体膜同志の会合がおこり、結晶体様小胞体が形成される可能性が示唆される。

The membrane proteins of COS cells were detected by gene transfer method, and most of the tubular vesicles were found to be regularly aligned and crystalline vesicles were found to be intracellular. The protein was introduced into COS cells by light antibody method and immunoelectrophotography method, and then analyzed by 2-fold staining, msALDH and intrinsic microsomal protein. As a result, wild-type msALDH was found in COS cells, which had crystalline vesicles formed around the nucleus, and msALDH had crystalline vesicles on the membrane, which had an acidifying enzyme present in the lumen. The analysis of the mechanism for the formation of crystals and small cells was also carried out. The watery field at the C-terminal of msALDH (C-terminal-site) migrates to the cell membrane and the appearance of crystal-like cell bodies in the variant of msALDH is visible. CAT's C-terminal msALDH and C-terminal 35 residues bind to the protein and the microcellular structure. The above results show that the formation of small crystal bodies is necessary for the formation of small cell membranes. The possibility of the formation of crystals and small cells is demonstrated by the presence of most msALDH molecules in small cell membranes and by the association of small cell membranes.

项目成果

Yamamoto,A,Masaki,R,and Tashiro Y,: "Cnalyses of the formatin of crystalloid endoplasnc reficulum in cos cells by CDNA transfection" cell struct Funct.(abstiact). (in press). (1994)

Yamamoto，A，Masaki，R，和 Tashiro Y，：“通过 CDNA 转染对 cos 细胞中晶体内质网的形成素进行分析”细胞结构功能。（抽象）。