内向き整流Kチャネルの生合成・細胞内輸送および細胞膜上における分布様式の解析

内向整流钾通道的生物合成、细胞内转运和细胞膜分布模式分析

• 批准号: 07670068
• 负责人: 大森 浩一郎
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670068/
• 关键词: 内向き整流Kチャネル; COS1細胞; 遺伝子導入; 部位指定突然変異法; glutathione S-transferase

内向き整流Kチャネルは種々の細胞に存在し,静止膜電位の保持,活動電位持続時間の調整,細胞の興奮性の調節などに機能していると考えられている。我々はマウス・マクロファージ由来の細胞からcDNAクローニングされた内向き整流Kチャネル(IRK1)をCOS1細胞にトランスフェクトする実験系を用いて以下の結果を得た。1.IRK1のcDNAをCOS1細胞に導入すると心筋内向き整流Kチャネルと同様のコンダクタンスを持つKチャネル活性が発現できた。2、このチャネルの外向き電流は細胞内Mgによってブロックされ,またμMレベルの細胞内Mg存在下で単一電流の1/3と2/3の大きさのサブレベルが出現する。3、IRK1のH5領域にある138番目のグルタミン酸をグルタミンに変換したmutant(E138Q)はKチャネル活性を発現しなかった。しかしながら,wild typeとE138Qを直列に連結した2量体cDNAをCOS1細胞に導入した場合には通常よりコンダクタンスの小さいKチャネル活性が出現した。H5領域の138番目のグルタミン酸はコンダクタンスに関係していると思われる。4、部位指定突然変異法を用い,IRK1が直列に連結された2,3,4,5,6,7,8量体cDNAを作製し,それぞれをCOS1細胞に導入した。その結果2〜8量体全ての場合にKチャネル活性が発現した。さらにIRK1の236番目のIleからC末端まで(193アミノ酸残基)をglutathione S-transferaseと融合させたfusion-geneを作製し,大腸菌に融合蛋白質を作製させた。SDS-PAGEで分析したところ分子量約5万の融合蛋白質が検出された。現在,この蛋白質を大量精製し家兎に免疫している。

Introverted き rectifier K チ ャ ネ ル は kind 々 し に の cells exist, resting membrane potential の keep, activity potential の 続 time adjustment, cell excitability の の regulation な ど に function し て い る と exam え ら れ て い る. I 々 は マ ウ ス · マ ク ロ フ ァ ー ジ origin の cells か ら cDNA ク ロ ー ニ ン グ さ れ た introverted き rectifier K チ ャ ネ ル (IRK1) を COS1 cells に ト ラ ン ス フ ェ ク ト す る be を 験 department with い て の results under を た. 1. IRK1 の cDNA を COS1 cells に import す る と heart muscle introverted き rectifier K チ ャ ネ ル と with others の コ ン ダ ク タ ン ス を hold つ K チ ャ ネ ル active が 発 now で き た. 2, こ の チ ャ ネ ル の outgoing き current Mg は cell に よ っ て ブ ロ ッ ク さ れ, ま た microns レ ベ ル の cells in the presence of Mg で 単 a current の 1/3 と two-thirds の き さ の サ ブ レ ベ ル が appear す る. 3, IRK1 の H5 field に あ る 138's mesh の グ ル タ ミ ン acid を グ ル タ ミ ン に variations in し た mutant (E138Q) は K チ ャ ネ ル active を 発 now し な か っ た. し か し な が ら, wild type と E138Q を inline に link し た 2 quantity body cDNA を COS1 cells に import し た occasions に は usually よ り コ ン ダ ク タ ン ス の small さ い K チ ャ ネ ル active が appear し た. H5 field の 138's mesh の グ ル タ ミ ン acid は コ ン ダ ク タ ン ス に masato is し て い る と think わ れ る. 4, place designated suddenly - different を い, IRK1 が inline に link さ れ た 2,3,4,5,6,7,8 quantity body cDNA を as し, そ れ ぞ れ を COS1 cells に import し た. The そ <s:1> results showed that the にKチャネ チャネ activity が occurred in all て <e:1> situations of the 2 to 8 volumes and た た. さ ら に IRK1 の 236's mesh の Ile か ら C terminal ま で (193 ア ミ ノ acid residue) を glutathione S transferase - と fusion さ せ た fusion - gene system し を, coliform に fusion protein を cropping さ せ た. SDS-PAGEで analyzed the fusion protein of approximately 50,000 molecular weights が検 out された. Now, the <s:1> <s:1> protein を is refined in large quantities to immunize the に of human rabbits with <s:1> て る る.

项目成果

大森浩一郎: "膜輸送蛋白-構造と機能,発現調節に関する最近の基礎研究の進歩-Na,K-ATPase" 日本臨牀. 54(印刷中). (1996)

Koichiro Omori：“膜转运蛋白 - 结构、功能和表达调控基础研究的最新进展 - Na,K-ATP 酶”Nippon Rinsho 54（出版中）。

Uriu-Mikami, T.: "Distribution of neurone-specific clathrin light chain b between clathrin-coated vesicle subclasses." NeuroReport. 6. 1922-1926 (1995)

Uriu-Mikami, T.：“神经元特异性网格蛋白轻链 b 在网格蛋白包被的囊泡亚类之间的分布。”

Omori, K.: "properties of cloned inwardly rectifying potassium channels expressed in COS-1 cells." The Japanese Journal of Physiology. 45 Suppl.1. S118-S118 (1995)

Omori, K.：“COS-1 细胞中表达的克隆内向整流钾通道的特性。”