ヒト老化マーカータンパクSMP30の年齢推定への応用

人类衰老标志蛋白SMP30在年龄估计中的应用

基本信息

批准号：
07670501
负责人：
木村章彦
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Wakayama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670501/
关键词：
SMP30 老化モノクローナル抗体年齢推定

项目摘要

ラット肝のホモジネイトから硫安分画、蔗糖濃度勾配IEF、ゲル濾過後、二次元電気泳動によりラットSMP30を、SDS-PAGEにおいてほぼ単一なバンドとして精製することができた。このラットSMP30を抗原として、ウサギに免疫し、ラットSMP30に対する十分な力価を有する抗血清を得、ハイドロキシアパタイトカラムにより精製してIgG画分とした。このIgG画分をホルミルセルロファインにカップリングしアフィニティーゲルを作製した。剖検時に採取したヒト肝のホモジネイトの硫安分画をこのアフィニティーカラムにかけ、その結合画分よりヒトSMP30をほぼ単一に精製した。ここで得られたヒトSMP30を抗原としてマウスに足底免疫し、モノクローナル抗体の作製を行ったが、十分な特異性と安定性を有するクローンを得ることはできなかった。そこで、免疫法を腹腔免疫に変更して再度モノクローナル抗体の作製を行ったが、足底免疫とほぼ同様の結果に終わった。これは、精製ヒトSMP30中に微量に存在する夾雑物の免疫原性が高く、ヒトSMP30に対するクローンの活性化を妨げるためと考えられる。そこで現在、今回抗原として用いたヒトSMP30をIEFおよび二次元電気泳動により更に精製を進め、これを抗原としてモノクローナル抗体の作製を行っており、まもなくヒトSMP30に対するモノクローナル抗体が得られるものと思われる。今後、引き続き本研究の最終的目的であるヒトにおけるSMP30を指標とする年齢推定法の確立まで研究を進める予定である。

大鼠SMP30可以从大鼠肝匀浆中纯化，因为硫酸铵馏分，蔗糖浓度梯度IEF，凝胶过滤和大鼠SMP30通过二维电泳。该大鼠SMP30被用作免疫兔子免疫的抗原，并获得了针对大鼠SMP30的足够滴度的抗血清，通过羟基磷灰石柱将其纯化以形成IgG分数。将此IgG馏分耦合到甲基纤维素中以制备亲和力凝胶。在尸检时收集的人肝匀浆的硫酸铵馏分被应用于该亲和力柱，并将人类SMP30从结合部分纯化为几乎单个纯化。此处获得的人类SMP30被用作植物免疫以产生单克隆抗体的抗原，但是无法获得足够特异性和稳定性的克隆。因此，将免疫方法更改为腹膜免疫，并再次产生单克隆抗体，但结果几乎与足底免疫相同。这被认为是因为纯化的人类SMP30中存在的痕量中存在的污染物具有高度免疫原性，从而阻止了克隆对人SMP30的激活。因此，用作抗原的人类SMP30现在被IEF和二维电泳进一步纯化，并且单克隆抗体被用作抗原，并且据信很快将获得针对人SMP30的单克隆抗体。将来，我们计划继续研究使用SMP30作为指数建立年龄估计方法，这是本研究的最终目标。