P-gingivalisスーパーオキシドジスムターゼの部位特異的変異導入

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〈目的〉Porphyromonas gingivalis(P. g. )のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、マンガンと鉄の両者で活性を示す特徴を有する。本研究は、酵素の構造と金属の選択性の関係を検討するためP. g. -SODの活性中心近傍に位置するアミノ酸に変異を導入し、Fe-あるいはMn-SOD型に変化させた酵素を得ることを目的とした。〈方法〉P. g.ATCC33277から得たSOD遺伝子を含む組換え体pKD210(Nakayama, K. Gene 96 149-150, 1990)からKunkelの方法を用いて部位特異的変異を導入した。得られた変異DNAをpUC18に再度クローニングし、E. coliのSOD欠損株(QC 774)で発現させ、性質を比較した。〈結果と考察〉1。未変異の組換え体SODは、二量体1モルあたり1.10モルのFeおよび0.38モルのMnを含み、比活性は1600units/mg protein/mol of metalであった。FeおよびMn再構成SODは、金属含有量比活性ともに精製酵素とほぼ同様の値を示し、組換え体酵素が金属寛容性の研究に用い得る、と判断された。2。72-LeuのコドンCTCをTGGに、77-TyrのコドンTATをTTTに変異させ、夫々72-Trp、77-Pheに置換する組換え分子を得た。両分子とも変異部位以外の塩基配列に変化の無いことを確認し、各々をpUCに18に再クローニングしてQC774で発現させた。3。酵素活性を比較すると、未変異SOD活性を100とした時、72-Trpおよび77-Phe酵素の活性は各々93、14であった。77-Phe変異(Mn-型への変異)が酵素活性に障害を与えることから、77-TryはSOD活性発現の機構に大きく関与している、と考えられた。今後、変異酵素の化学的性質について検討する予定である。