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P-gingivalisスーパーオキシドジスムターゼの部位特異的変異導入

P-牙龈超氧化物歧化酶的定点诱变

基本信息

批准号：
07807171
负责人：
平岡行博
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Matsumoto Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

〈目的〉Porphyromonas gingivalis(P. g. )のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、マンガンと鉄の両者で活性を示す特徴を有する。本研究は、酵素の構造と金属の選択性の関係を検討するためP. g. -SODの活性中心近傍に位置するアミノ酸に変異を導入し、Fe-あるいはMn-SOD型に変化させた酵素を得ることを目的とした。〈方法〉P. g.ATCC33277から得たSOD遺伝子を含む組換え体pKD210(Nakayama, K. Gene 96 149-150, 1990)からKunkelの方法を用いて部位特異的変異を導入した。得られた変異DNAをpUC18に再度クローニングし、E. coliのSOD欠損株(QC 774)で発現させ、性質を比較した。〈結果と考察〉1。未変異の組換え体SODは、二量体1モルあたり1.10モルのFeおよび0.38モルのMnを含み、比活性は1600units/mg protein/mol of metalであった。FeおよびMn再構成SODは、金属含有量比活性ともに精製酵素とほぼ同様の値を示し、組換え体酵素が金属寛容性の研究に用い得る、と判断された。2。72-LeuのコドンCTCをTGGに、77-TyrのコドンTATをTTTに変異させ、夫々72-Trp、77-Pheに置換する組換え分子を得た。両分子とも変異部位以外の塩基配列に変化の無いことを確認し、各々をpUCに18に再クローニングしてQC774で発現させた。3。酵素活性を比較すると、未変異SOD活性を100とした時、72-Trpおよび77-Phe酵素の活性は各々93、14であった。77-Phe変異(Mn-型への変異)が酵素活性に障害を与えることから、77-TryはSOD活性発現の機構に大きく関与している、と考えられた。今後、変異酵素の化学的性質について検討する予定である。

〈Purpose〉Porphyromonas gingivalis (P. g. )のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、マンガンと鉄の両人でACTIVE をshowす特徴を有する. In this study, the relationship between the structure of the enzyme and the selection and properties of the metal was discussed. P. g. -SOD's active center is close to the location of the acid, and the Fe-あるいはMn-SOD type enzyme is transformed into the enzyme. <Method> P. g.ATCC33277 was obtained by SOD and replaced with pKD210 (Nakayama, K. Gene 96 149-150, 1990) からKunkel's method uses いて site-specific changes to introduce した. The heterogeneous DNA pUC18 was obtained and the SOD defective strain of E. coli (QC 774) was reproduced and its properties were compared. 〈Results and Investigation〉1. The unmodified compound is SOD, the second compound is 1モルあたり1.10モルのFeおよび0.38モルのMnをcontaining, and the specific activity is 1600units/mg protein/mol of metalであった. FeおよびMn reconstituted SODは, metal content specific activity, purified enzyme, and the same 様の値をshow, group-replacement body enzyme, metal capacitance research, use, and judgment. 2. 72-LeuのコドンCTCをTGGに, 77-TyrのコドンTATをTTTに変differentさせ, husband々72-Trp, 77-Pheにsubstitutionする组词moleculeをgetた.両The molecular arrangement of the base group other than the different parts of the molecule has not been confirmed, and each of the 々をpUCに18にクローニングしてQC774 is now the same. 3. The enzyme activity is comparatively high, the SOD activity is 100 とした, and the activity of 72-Trp 77-Phe enzyme is 93 each, and 14 であった. 77-Phe (Mn-type への変different) does not impede enzyme activity and えることから, 77-Try は SOD active appearance の mechanism に大きく关 and している、と考えられた. From now on, the chemical properties of the isozyme will be determined in advance.