細菌によるワックスエステル合成のための代謝工学

1)ワックスエステル合成に関与する酵素遺伝子のクローニングn-アルカン資化性菌Acinetobacter sp.M-1株より、ワックスエステル合成の最終段階を触媒する酵素、acyl-CoA : alcohol transferaseを精製し、酵素化学的諸性質を明らかにするとともに、その推定アミノ酸配列の情報を基に、当該遺伝子をクローニングした。さらに、当該遺伝子をプラスミドpKT231に組み換えて大腸菌に形質転換し、大腸菌の無細胞抽出液中に本酵素活性を認め、本遺伝子が目的の酵素をコードしていることを確認した。2)ワックスエステル分解酵素欠損株の取得Acinetobacter sp.M-1株の無細胞抽出液中に、ワックスエステルを加水分解するエステラーゼの活性を認め、精製してN-末端および内部アミノ酸配列を決定した。これを基に当該遺伝子をクローニングした。遺伝子の組換えによってこの遺伝子破壊株を得ることは出来なかったが、通常の変異処理によりこのエステラーゼの活性を示さない変異株(et株)を得ることができた。3)代謝工学的手法によるワックスエステル合成菌株の育種et株を宿主として、これにacyl-CoA : alcohol transferase遺伝子を保持したプラスミドpKT231-WSを形質転換した。その結果、形質転換株のacyl-CoA : alcohol transferase活性は元株の約120倍の活性を示した。この株を用い、n-ヘキサデカンを炭素源とした窒素制限培地で培養することにより、ワックスエステルの蓄積量は菌体重量の37%にまで達した。これは元株の2.6倍の蓄積量である。また、元株と異なり、蓄積したワックスエステルは、n-ヘキサデカンが消費された後でもほとんど分解されることなく、安定に蓄積した。

1)ワックスエステル合成に関与する酵素遺伝子のクローニングn-アルカン資化性菌Acinetobacter sp.M-1株より、ワックスエステル合成の最終段階を触媒する酵素、acyl-CoA : alcohol transferaseを精製し、酵素化学的諸性質を明らかにするとともに、その推定アミノ酸配列の情報を基に、当該遺伝子をクローニングした。さらに、当該遺伝子をプラスミドpKT231に組み換えて大腸菌に形質転換し、大腸菌の無細胞抽出液中に本酵素活性を認め、本遺伝子が目的の酵素をコードしていることを確認した。2)ワックスエステル分解酵素欠損株の取得Acinetobacter sp.M-1株の無細胞抽出液中に、ワックスエステルを加水分解するエステラーゼの活性を認め、精製してN-末端および内部アミノ酸配列を決定した。これを基に当該遺伝子をクローニングした。遺伝子の組換えによってこの遺伝子破壊株を得ることは出来なかったが、通常の変異処理によりこのエステラーゼの活性を示さない変異株(et株)を得ることができた。3)代謝工学的手法によるワックスエステル合成菌株の育種et株を宿主として、これにacyl-CoA : alcohol transferase遺伝子を保持したプラスミドpKT231-WSを形質転換した。その結果、形質転換株のacyl-CoA : alcohol transferase活性は元株の約120倍の活性を示した。この株を用い、n-ヘキサデカンを炭素源とした窒素制限培地で培養することにより、ワックスエステルの蓄積量は菌体重量の37%にまで達した。これは元株の2.6倍の蓄積量である。また、元株と異なり、蓄積したワックスエステルは、n-ヘキサデカンが消費された後でもほとんど分解されることなく、安定に蓄積した。