FRETを用いたエキソサイトーシス時のリガンド、受容体の細胞内移動の解析

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蛋白質をはじめとする生体内機能分子の働きを生きた細胞内で観測する手段として、蛍光蛋白質を利用したFRET(Fluorescence energy transfer、蛍光エネルギー移動)を用いたエキソサイトーシス時のリガンド、受容体の細胞内移動動態を観察するために設定したFRETを用いたシステムの立ち上げに困難さを経験している。そこで、まず、いままでに実績のある、細胞内メッセンジャータンパク質である低分子量G蛋白のRasとRhoとおよびそのエフェクター蛋白であるRaf, PKNとの間のFRET現象の観察を試みた。細胞は我々にとって使い慣れており、かつ管理および操作が容易なCaov3(ヒト卵巣癌細胞由来細胞株)を用いた。RASにYFP(黄色蛍光色素)、RafにCFP(青色蛍光色素)を含むプラスミドを作成した。両者を一時的に発現することには成功したが、その安定的観察のためにはなんらかの科学的捜査が必要である。またFRET現象を観察するためには2分子の安定的バランスが必要である。両蛋白を同時に等量づつ発現させるために2つのプラスミドをhinge(蝶番)でつないで一つのプラスミドとして均等に発現するようシステムを開発中であるが、未だ確立に至っていない。平行してRhoにCFP、PKNにYFPをつないだプラスミドを作成し、検討も行っているが同様の問題を解決できないでいる。以上の困難さより計画自身の遂行にも困難さを来している。