蛍光マイクロビーズアレイを用いたレクチン糖結合特異性の網羅的解析

使用荧光微珠阵列综合分析凝集素糖结合特异性

• 批准号: 14658191
• 负责人: 山本 一夫
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658191/
• 关键词: レクチン; 糖結合特異性; 蛍光マイクロビーズ; アレイテクノロジー; 蛍光分析; マイクロビーズアレイ

16種類の蛍光マイクロビーズに、それぞれ異なる精製糖ペプチドを固相化した。固相化した糖ペプチドは、糖タンパク質であるチログロブリン、卵白アルブミン、ウシ顎下腺ムチン、ブタ顎下腺ムチンから、それぞれプロナーゼ消化、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、レクチンアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、MALDI-TOF MSの質量分析等により、構造解析を行った。これらの標品の中から、N-結合型糖鎖の高マンノース型、複合型、個運勢型糖鎖を、また0-結合型糖鎖の典型的なもの2つを合わせ、蛍光マイクロビーズに水溶性カルボジイミドを用いて共有結合させた。これらの糖ペプチドを付加した蛍光マイクロビーズと、28種類のレクチン、ならびに細胞内品質管理に関与しているERGIC-53,VIP36との結合を、サイトフローメトリーで解析した。28種類の植物由来レクチンに関しては、非特異的な吸着の大きなものからほとんど無いものまでさまざまであり、コントロールをどのように選択するかが問題であった。非特異的結合は主に疎水的なものであり、BSAのようなものは必ずしも適切ではなかった。一方、ERGIC-53,VIP36との結合実験では、pH依存的な影響を見た。ERGIC-53では、pH依存的な結合の増減は観察されなかったが、VIP36ではBIAcoreを用いた表面プラズモン共鳴で観察されていた結果と同様に、pH依存的な結合の強弱も観察することができた。ビーズアレイはさまざまな糖鎖に対する親和性の相対的な違いを定量化することを目的としているが、絶対的な結合力もそのシグナル強度から見積もることが可能であり、定性的、かつ定量的な解析が可能であった。汎用性という点で、糖アルコールやオリゴ糖の固相化条件も検討したが、リガンドの密度を揃えることが大切であり、予めビオチン化したリガンドを調製し、これらをアビジン標識した蛍光ビーズにカップリングすることが良いと思われた。

16 kinds of light, light Solid phase transformation, sugar selection, sugar quality, protein extraction, submandibular gland selection, submandibular gland selection, digestion, exchange, purification, MALDI-TOF MS mass analysis, structural analysis, etc. The standard products include high solubility, complex, individual fortune and 0-binding glycans. The typical types of glycans are water soluble, light soluble, and water soluble. ERGIC-53,VIP-36, and the analysis of 28 kinds of intracellular quality management. 28 species of plants origin, non-specific adsorption, large number of species, non-specific adsorption, non-specific adsorption, non-specific Non-specific binding is not appropriate for BSA. A combination of ERGIC-53,VIP36, and a pH-dependent effect can be seen. ERGIC-53, pH-dependent binding increases and decreases, VIP-36, BIAcore uses surface resonance to detect the same, pH-dependent binding. The affinity of the sugar chain is quantified, the purpose is determined, and the binding strength of the sugar chain is determined. The conditions for solid-phase transformation of sugar are discussed in detail. The density of sugar is greatly reduced. The density of sugar is modulated.

项目成果

K.Tajima: "Augmentation of NK cell-mediated cytotoxicity to tumor cells by inhibitory NK cell receptor blockers."Int.Immunol.. 16・3. 385-393 (2004)

K. Tajima：“通过抑制性 NK 细胞受体阻断剂增强 NK 细胞介导的细胞毒性。” Int. 16・3 (2004)。

K.Yamamoto: "Protein Protocols Handbook, 2nd Edition"Affinity chromatography of oligosaccharides and glycopeptides with immobilized lectins. 917-931 (2002)

K.Yamamoto：“蛋白质实验方案手册，第二版”固定化凝集素的寡糖和糖肽的亲和层析。

H.Wada: "The inhibitory NK cell receptor CD94/NKG2A and the activating receptor CD94/NKG2C bind the top of HLA-E through mostly shared but partly distinct sets of HLA-E residues."Eur.J.Immunol.. 34. 81-90 (2004)

H.Wada：“抑制性 NK 细胞受体 CD94/NKG2A 和激活受体 CD94/NKG2C 通过大部分共享但部分不同的 HLA-E 残基组结合 HLA-E 顶部。”Eur.J.Immunol.. 34。

Sakamoto H.: "Modulation of heat-shock protein 27 (Hsp27) anti-apoptotic activity by methylglyoxal modification"J. Biol. Chem.. 277. 45770-45775 (2002)

Sakamoto H.：“通过甲基乙二醛修饰调节热休克蛋白 27 (Hsp27) 抗凋亡活性”J。

Sun Y.: "Characterization and expression of L-amino acid oxidase of mouse milk"J. Biol. Chem.. 277. 19080-19086 (2002)

孙Y.：“小鼠乳汁L-氨基酸氧化酶的表征及表达”J.