上皮成長因子(EGF)レセプターの細胞内増殖シグナル伝達機構の分子生物学的解析

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1.Site-directed mutagenesis法により自己リン酸化部位のチロシン残基をフェニルアラニンに、またATP結合部位(721位)のリジンをアラニンに置換した変異型EGFレセプターcDNAを作製した。野性型およびこれらの変異型EGFレセプターcDNAをCHO細胞にトランスフェクションし、野性型および変異型レセプターを発現するCHO細胞株を樹立した。^3H-thymidine取り込みを指標としてみたDNA合成能は、複数のmajorなリン酸化チロシン残基を置換した変異株とリジンを置換した変異株で低下した。2.RasGTPase活性化蛋白(GAP)およびphosphatidyl inositol3-kinase(PI3K)のsrc homology2(SH2)ドメインを含む領域をglutathione-S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌で作製した。In vitroでは、これらの蛋白はEGFレセプターとアソシエーションした。一方、in vivoでは、EGFレセプターを免疫沈降し、SDS-PAGE後、抗GAP抗体および抗PI3K(85kDaサブユニット)抗体を用いてイムノブロットを行なっても、GAPおよびPI3K蛋白を同定できなかった。3.野性型EGFレセプターを発現するCHO細胞において、抗EGFレセプター抗体あるいは抗リン酸化チロシン抗体での免疫沈降物中のPI3K活性を測定すると、EGF刺激によりPI3K活性は2-3倍に増加したものの、わずかな増加に留まった。一方、抗p21^<ras>抗体を用いて、p21^<ras>-GTP/p21^<ras>-GDP比を測定すると、野性株ではEGF刺激によりGTP結合型p21^<ras>が増加した。したがって、以上の結果から、GAPおよびPI3KはEGFレセプターの有力なシグナル伝達物質ではないと考えられた。4.最近、EGFレセプターを介するシグナル伝達物質の候補としてASH(GRB2)およびSHCが同定され、目下、これらの蛋白について検討を行なっている。