上皮成長因子(EGF)レセプターの細胞内増殖シグナル伝達機構の分子生物学的解析

表皮生长因子（EGF）受体细胞内增殖信号转导机制的分子生物学分析

• 批准号: 04671478
• 负责人: 岡林 克典
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04671478/
• 关键词: 上皮成長因子(EGF)レセプター; rasGTPase活性化蛋白; ホスファチジルイノシトール3キナーゼ; 分子生物学

1.Site-directed mutagenesis法により自己リン酸化部位のチロシン残基をフェニルアラニンに、またATP結合部位(721位)のリジンをアラニンに置換した変異型EGFレセプターcDNAを作製した。野性型およびこれらの変異型EGFレセプターcDNAをCHO細胞にトランスフェクションし、野性型および変異型レセプターを発現するCHO細胞株を樹立した。^3H-thymidine取り込みを指標としてみたDNA合成能は、複数のmajorなリン酸化チロシン残基を置換した変異株とリジンを置換した変異株で低下した。2.RasGTPase活性化蛋白(GAP)およびphosphatidyl inositol3-kinase(PI3K)のsrc homology2(SH2)ドメインを含む領域をglutathione-S-transferaseとの融合蛋白として大腸菌で作製した。In vitroでは、これらの蛋白はEGFレセプターとアソシエーションした。一方、in vivoでは、EGFレセプターを免疫沈降し、SDS-PAGE後、抗GAP抗体および抗PI3K(85kDaサブユニット)抗体を用いてイムノブロットを行なっても、GAPおよびPI3K蛋白を同定できなかった。3.野性型EGFレセプターを発現するCHO細胞において、抗EGFレセプター抗体あるいは抗リン酸化チロシン抗体での免疫沈降物中のPI3K活性を測定すると、EGF刺激によりPI3K活性は2-3倍に増加したものの、わずかな増加に留まった。一方、抗p21^<ras>抗体を用いて、p21^<ras>-GTP/p21^<ras>-GDP比を測定すると、野性株ではEGF刺激によりGTP結合型p21^<ras>が増加した。したがって、以上の結果から、GAPおよびPI3KはEGFレセプターの有力なシグナル伝達物質ではないと考えられた。4.最近、EGFレセプターを介するシグナル伝達物質の候補としてASH(GRB2)およびSHCが同定され、目下、これらの蛋白について検討を行なっている。

1.Site-directed mutagenesis method for the preparation of EGF cDNA from the nucleotide residues of the acid site of EGF and the ATP-binding site (position 721). CHO cell lines were established to express wild-type and heteromorphic EGF cDNA in CHO cells. 3H-thymidine is an important indicator that DNA synthesis can be reduced by replacing multiple major linker residues with mutants and mutants. 2. The src homology2(SH2) of RasGTase activating protein (GAP) and phosphosyl inositol3-kinase(PI3K) is a fusion protein containing glutathione-S-transferase and is produced in Escherichia coli. In vitro, the EGF solution was found to be optimal. One side, in vivo, EGF protein, after SDS-PAGE, anti-GAP antibody and anti-PI 3K (85kDa) antibody, GAP protein and PI 3K protein were identified. 3. The PI3K activity in CHO cells produced by wild-type EGF was measured by anti-EGF antibodies and anti-EGF antibodies. The PI3K activity was increased by 2-3 fold under EGF stimulation. The ratio of <ras>p21^<ras>-GTP to p21^<ras>-GDP was determined by using anti-p21 ^antibodies<ras>. The above results show that the GAP and PI3K are the most powerful substances in EGF. 4. Recently, EGF has been selected as a candidate for the detection of ASH(GRB2) and SHC.