上皮成長因子(EGF)受容体の新しいシグナル蛋白のクローニングと機能解析

表皮生长因子（EGF）受体新信号蛋白的克隆及功能分析

• 批准号: 06671031
• 负责人: 岡林 克典
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06671031/
• 关键词: EGF受容体; Vav homolog; シグナル伝達

本研究では血球系以外の細胞に発現するVavのhomologをクローニングし、上皮成長因子(EGF)受容体を介するシグナル伝達における役割を明らかにしようとした。Vav、Dbl、Bcr、Ras-GRFにみられるDbl-like homology domainのkonsensus amino acid sequence SLLXKPVQRおよびFLFEK ALLLCに相当するsense primer 5′>GCGGGATCCT||(T/A)(C/G)(A/G)(A/T)(A/G)CC(A/T)(G/A)TG(C/G)AICG<3′とantisense primer5′>CGCGAATTCA(T/G)I(G/A)(C/G)(T/C)T(T/C)(T/G)(T/G)(C/T)I(T/A)(A/G)CA(A/G)GAA<3′を作成し、A172、Panc1、HelaおよびChinese hamster ovary細胞よりRNAを抽出しRT-PCRによりcDNAを増幅した。また、ヒト乳癌細胞cDNAライブラリーを鋳型としてPCRによりcDNAを増幅した。その結果、期待される約300bpのサイズのcDNAが増幅され、このcDNAをM-13ベクターに組み込み、シークエンスを行った結果、未知の塩基配列を持つ33種のcDNAが得られた。これらの個々のcDNAの塩基配列をアミノ酸に変換後、Vavのアミノ酸配列とホモロジー検索すると、高いもので25-30%のホモロジーがあった(同部位のVavとDblのホモロジーは29%であった)。Vavとホモロジーの高いクローンから順次、ラット脳cDNAライブラリー(>300万個)、皮膚線維芽細胞cDNAライブラリー(>100万個)等をスクリーニングしたが、未だpositive cloneは得られず、種種のcDNAライブラリーで引き続きスクリーニング中である。また、Jurkat細胞からRNAを抽出しRT-PCRにてVav cDNAの一部を増幅して得た。このVav cDNAをプローブとしてlow stringencyの条件でpositive cloneの得られるcDNAライブラリーを見い出し、そのcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行おうとしている。

In this study, we investigated the expression of VAV homolog and EGF receptor in cells other than hematopoietic cells. Vav, Dbl, Bcr, Ras-GRF, Dbl-like homology domain konsensus amino acid sequence SLLXKPVQR and FLFEK ALLLC sense primer 5′> GCGGATCCT|| (T/A)(C/G)(A/G)(A/T)(A/G)CC(A/T)(G/A)TG(C/G)AICG<3′ antisense primer 5 ′>CGCGAATTCA(T/G)I(G/A)(C/G)(T/C)T(T/C)(T/G)(C/T)I(T/A)(A/G)CA(A/G)GAA<3′ RNA extraction from A172, Panc1, Hela, and Chinese hamster ovary cells increased in RT-PCR amplitude. The DNA of breast cancer cells was amplified by PCR. The results showed that the cDNA of about 300bp was amplified, the cDNA of M-13 was assembled, the cDNA of M-13 was assembled, and the cDNA of 33 species was obtained. The nucleotide sequence of the cDNA was changed to 25-30% of the nucleotide sequence of the VAV. Vav RNA was extracted from Jurkat cells and a portion of Vav cDNA was amplified by RT-PCR. The condition of low mobility of the Vav cDNA is that the positive clone is obtained from the Vav cDNA.

项目成果

Yoshinori Okabayashi: "Tyrosine 1148 and 1173 of activated human epidermal growth factor receptors are binding site of shc in intact cells." Journal of Biological Chemistry. 269. 18674-18678 (1994)

Yoshinori Okabayashi：“激活的人表皮生长因子受体的酪氨酸 1148 和 1173 是完整细胞中 shc 的结合位点。”

Toshio Okutani: "Grbz/Ash binds directly to tyrosines 1068 and 1086 and indirectly to tyrosine 1148 of activated human epidermal growth factor receptors in intact cells." Journal of Biological Chemistry. 269. 31310-31314 (1994)

Toshio Okutani：“Grbz/Ash 直接与完整细胞中激活的人表皮生长因子受体的酪氨酸 1068 和 1086 结合，并间接与酪氨酸 1148 结合。”

Yoshiaki Kido: "EGF-induced activation of 70-kDa S6 Kinase in CHO cells expressing human EGF receptors." Biochemical and Biophysical Research Communications. in press.

Yoshiaki Kido：“在表达人类 EGF 受体的 CHO 细胞中，EGF 诱导激活 70-kDa S6 激酶。”