上皮成長因子(EGF)受容体の新しいシグナル蛋白のクローニングと機能解析

本研究では血球系以外の細胞に発現するVavのhomologをクローニングし、上皮成長因子(EGF)受容体を介するシグナル伝達における役割を明らかにしようとした。Vav、Dbl、Bcr、Ras-GRFにみられるDbl-like homology domainのkonsensus amino acid sequence SLLXKPVQRおよびFLFEK ALLLCに相当するsense primer 5′>GCGGGATCCT||(T/A)(C/G)(A/G)(A/T)(A/G)CC(A/T)(G/A)TG(C/G)AICG<3′とantisense primer5′>CGCGAATTCA(T/G)I(G/A)(C/G)(T/C)T(T/C)(T/G)(T/G)(C/T)I(T/A)(A/G)CA(A/G)GAA<3′を作成し、A172、Panc1、HelaおよびChinese hamster ovary細胞よりRNAを抽出しRT-PCRによりcDNAを増幅した。また、ヒト乳癌細胞cDNAライブラリーを鋳型としてPCRによりcDNAを増幅した。その結果、期待される約300bpのサイズのcDNAが増幅され、このcDNAをM-13ベクターに組み込み、シークエンスを行った結果、未知の塩基配列を持つ33種のcDNAが得られた。これらの個々のcDNAの塩基配列をアミノ酸に変換後、Vavのアミノ酸配列とホモロジー検索すると、高いもので25-30%のホモロジーがあった(同部位のVavとDblのホモロジーは29%であった)。Vavとホモロジーの高いクローンから順次、ラット脳cDNAライブラリー(>300万個)、皮膚線維芽細胞cDNAライブラリー(>100万個)等をスクリーニングしたが、未だpositive cloneは得られず、種種のcDNAライブラリーで引き続きスクリーニング中である。また、Jurkat細胞からRNAを抽出しRT-PCRにてVav cDNAの一部を増幅して得た。このVav cDNAをプローブとしてlow stringencyの条件でpositive cloneの得られるcDNAライブラリーを見い出し、そのcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行おうとしている。

本研究では血球系以外の細胞に発現するVavのhomologをクローニングし、上皮成長因子(EGF)受容体を介するシグナル伝達における役割を明らかにしようとした。Vav、Dbl、Bcr、Ras-GRFにみられるDbl-like homology domainのkonsensus amino acid sequence SLLXKPVQRおよびFLFEK ALLLCに相当するsense primer 5′>GCGGGATCCT||(T/A)(C/G)(A/G)(A/T)(A/G)CC(A/T)(G/A)TG(C/G)AICG<3′とantisense primer5′>CGCGAATTCA(T/G)I(G/A)(C/G)(T/C)T(T/C)(T/G)(T/G)(C/T)I(T/A)(A/G)CA(A/G)GAA<3′を作成し、A172、Panc1、HelaおよびChinese hamster ovary細胞よりRNAを抽出しRT-PCRによりcDNAを増幅した。また、ヒト乳癌細胞cDNAライブラリーを鋳型としてPCRによりcDNAを増幅した。その結果、期待される約300bpのサイズのcDNAが増幅され、このcDNAをM-13ベクターに組み込み、シークエンスを行った結果、未知の塩基配列を持つ33種のcDNAが得られた。これらの個々のcDNAの塩基配列をアミノ酸に変換後、Vavのアミノ酸配列とホモロジー検索すると、高いもので25-30%のホモロジーがあった(同部位のVavとDblのホモロジーは29%であった)。Vavとホモロジーの高いクローンから順次、ラット脳cDNAライブラリー(>300万個)、皮膚線維芽細胞cDNAライブラリー(>100万個)等をスクリーニングしたが、未だpositive cloneは得られず、種種のcDNAライブラリーで引き続きスクリーニング中である。また、Jurkat細胞からRNAを抽出しRT-PCRにてVav cDNAの一部を増幅して得た。このVav cDNAをプローブとしてlow stringencyの条件でpositive cloneの得られるcDNAライブラリーを見い出し、そのcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行おうとしている。