酸性多糖とのハイブリッド化によるβ-ラクトグロブリンの機能改変

点击翻译按钮获取中文摘要

多糖としては、構造が比較的均一で、抗原性、免疫原性の低いデキストラン(分子量;10,000)を用い、アルカリ性モノクロル酢酸メタノール溶液中に溶解し、40℃で48時間反応させた後、酢酸でpH6.5に調整して反応を停止し、蒸留水に対して透析後、凍結乾燥して、カルボキシメチルデキストラン(CMD)を得た。次に、β-ラクトブロブリン(β-LG)とCMDを、水溶性カルボジイミド(1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprapyl)carbodiimide;EDC)を介して結合させた。β-LG、CMD、EDCの反応条件(配合比、配合順序、反応温度、反応pH)を検討し、最適の反応条件によりβ-LGとCMDを結合させた。得られたハイブリッドは、塩析ならびにイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ハイブリッド生成の確認については、SDS-PAGEならびに等電点電気泳動により行った。本研究においては2種類のハイブリッドが得られた。ハイブリッドの構造について、化学分析、CD測定、蛍光測定、モノクローナル抗体用いた酵素免疫測定法により、さらに、その、熱的構造安定性について、示差走査熱量測定により解析した。その結果、いずれのハイブリッドについても、タンパク質と酸性多糖の共有結合が確認され、局所的な若干の構造変化が検出されたものの、ネイティブなタンパク質構造がほぼ維持され、熱安定性は15℃以上上昇していた。ハイブリッドの機能については、まず、レチノール結合能の測定を行い、ハイブリッドが、β-LGの生理機能であるレチノールの結合能を保持していることを明らかにした。ハイブリッドの乳化性については、エマルションの安定性を濁度法にほり評価し、β-LGよりも優れた乳化性を有することを明らかにした。抗原性・免疫原性については、マウスにβ-LGあるいはハイブリッドを免疫して抗血清を得、特異抗体量を酵素免疫測定法により測定し、抗原性・免疫原性の低減化を明らかにした。以上のように、本研究により、酸性多糖の結合により、タンパク質の意図的な機能改変を達成することができた。