植物(レタス)の植物病原菌(レタスべと病菌)レース特異的抵抗反応機構の解明

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本研究の目標であるレタスとレタスべと病菌に見られる極めてクリア-な特異的相互認識、特異的病害抵抗機構の解明のため、当該抵抗性遺伝子クラスター近傍の染色体解析を行った。レタスの2000M base pair以上とされる巨大な染色体を直接解析する困難を回避するため、パルスフィールドゲルを用いることにより、近傍のRAPD・PCRマーカーを指標とした特定染色体およびその断片の濃縮法について検討した。パルスフィールドゲルの細かい泳動条件設定により、特定のサイズを持つ断片を効率よく濃縮し、比較的損傷の少ない状態で回収する技術を確立した。濃縮した染色体断片は、PCR法により目的の領域を含むことが示された。さらに詳細な近傍領域のマッピングにより、抵抗性遺伝子クラスターが、高度な繰り返し配列を持つこと、従って、染色体ウォーキングによるクローニングは極めて困難であることが示された。逆に、組換え体の解析およびマッピングデータから本領域が領域特異的な繰り返し配列と組み換えのホットスポットを有することが明かとなり、高等動物のMHC領域との類似性が想像された。しかしながら、高等動物と異なり、本領域はかなりの広範囲(数+Mb)にわたってスパンしており、本質的に動物と異なるシステムである可能性が高い。染色体ウォーキングによるクローニングの代替法として、大規模欠失変異株と野生株間でのサブトラクションクローニング法の適用を考え、ゲノムサイズのはるかに小さいモデル糸状菌を用いて技術的検討を行い、ディファレンシャルサブトラクション法の条件を確立した。