シナプス形成のメカニズム-原癌遺伝子c-srcの機能からの解析-

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我々は、シナプス形成のメカニズムを、原癌遺伝子c-srcのシナプスに於ける役割を解析することから明らかにすることを試みている。本年度の実施計画と得られた結果は以下のようである。1)シナプス構造のモデルシステムとして培養神経筋接合部を用いて、平成6年度に光顕レベルで明らかになった、培養神経細胞と筋細胞間のpp60^<c-src(+)>陽性の接触部について、電顕レベルのPAP法で解析した。その結果pp60^<c-src(+)>免疫反応陽性の神経突起のvaricosityと筋管細胞との間にシナプスが形成されている像が得られた。同様の解析を脊髄神経細胞のみの培養で観察すると神経細胞間においても神経突起上にしばしば、pp60^<c-src(+)>免疫反応陽性の他の神経細胞の神経突起のvaricosityが見られた。これを電顕レベルで観察した結果、シナプスが形成されていた。免疫反応産物は、前および後シナプス膜に沿った部分とシナプス小胞の膜に結合して見られた。この結果から、少なくともシナプス形成の初期においてpp60^<c-src(+)>が関与していることが示唆された。更にシナプス形成を他の方法で確認するために、神経細胞と筋細胞の共培養においてI^<125>-α-bung-arotoxinを用いてオートラジオグラフィーによりAChRのspotを証明することを試みた。この実験そのものは成功したが、pp60^<c-src(+)>免疫反応とAChRのspotの二重標識にはまだ成功していない。この点に関しさらに実験条件などを検討する必要がある。2)前年度に引き続き鶏胚脊髄シナプス部における神経特異的pp60^<c-src(+)>の局在を、特異抗体を用い、包埋前immunogold法、あるいは包埋後Pro-tein A-gold法により免疫細胞化学的に明らかにすることに関しては、pp60^<c-src(+)>の免疫反応性が強い固定液で失われるため難行している。固定条件、反応条件を模索中である。3)神経細胞と筋細胞の共培養において、神経細胞内にmicroinjectionにより抗pp60^<c-src(+)>抗体を注入する撹乱実験については、現在注入量、注入細胞を標識するための蛍光標識の工夫などについて予備実験を行なっている。