口腔類上皮癌KB細胞の産生する新しいTIMPの構造解析

ヒト口腔類上皮癌KB細胞培養液中に産生されるコラゲナーゼ阻害活性のうちTIMP-1を抗TIMP-1免疫吸着カラムで除去後、さらに残存するコラゲナーゼ阻害活性をSDS-PAGEで単一蛋白バンドとなるまで精製した。精製標品はコラゲナーゼの他ゼラチナーゼ、ストロムライシンをも阻害することからTIMPファミリーに属する蛋白と考えられた。(以下KB-TIMPと略す)。SDS-PAGE後PVDF膜へのウエスタンブロットを行ない、蛋白バンドを切り出しアミノ酸配列解析を行なったところ、TIMP-2のそれと一致した。しかし、その分子量はTIMP-2より約数kDa小さく、またTIMP-2は糖鎖を持たない事実からKB-TIMPはTIMP-2の低分子化したものと考えられた。TIMP-2はその性質としてプロゼラチナーゼAと複合体を形成し、その結合にはC末端から9個のペプチドが必須である。KB-TIMPをプロゼラチナーゼAと混ぜ、複合体形成をゼラチン-セファロースカラムで分析したところ、TIMP-2と異なり複合体を形成しなかった。またKB-TIMPおよびTIMP-2をトリプシン、V8プロテアーゼで分解し、その断片を比較検討したが、明かな違いを認めなかった。またTIMP-2のC末端から19個のペプチドに対し作成したポリクロナール抗体と反応した。これらの結果は、KB-TIMPはTIMP-2のC末端から多くとも9つのアミノ酸ペプチドがタンパク分解あるいは遺伝子欠損により消失したものである可能性を示唆している。

ヒト口腔類上皮癌KB細胞培養液中に産生されるコラゲナーゼ阻害活性のうちTIMP-1を抗TIMP-1免疫吸着カラムで除去後、さらに残存するコラゲナーゼ阻害活性をSDS-PAGEで単一蛋白バンドとなるまで精製した。精製標品はコラゲナーゼの他ゼラチナーゼ、ストロムライシンをも阻害することからTIMPファミリーに属する蛋白と考えられた。(以下KB-TIMPと略す)。SDS-PAGE後PVDF膜へのウエスタンブロットを行ない、蛋白バンドを切り出しアミノ酸配列解析を行なったところ、TIMP-2のそれと一致した。しかし、その分子量はTIMP-2より約数kDa小さく、またTIMP-2は糖鎖を持たない事実からKB-TIMPはTIMP-2の低分子化したものと考えられた。TIMP-2はその性質としてプロゼラチナーゼAと複合体を形成し、その結合にはC末端から9個のペプチドが必須である。KB-TIMPをプロゼラチナーゼAと混ぜ、複合体形成をゼラチン-セファロースカラムで分析したところ、TIMP-2と異なり複合体を形成しなかった。またKB-TIMPおよびTIMP-2をトリプシン、V8プロテアーゼで分解し、その断片を比較検討したが、明かな違いを認めなかった。またTIMP-2のC末端から19個のペプチドに対し作成したポリクロナール抗体と反応した。これらの結果は、KB-TIMPはTIMP-2のC末端から多くとも9つのアミノ酸ペプチドがタンパク分解あるいは遺伝子欠損により消失したものである可能性を示唆している。