イソプレノイドによる修飾蛋白質生合成系の解明

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Ras蛋白質をはじめとするイソプレノイド修飾蛋白質が機能するためには、そのイソプレニル化が必須である。それゆえ、そのイソプレニル化脂質、ファルネシル二リン酸(FPP)とゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)がどのように生合成されるのかを理解することにより、イソプレノイド修飾蛋白質を介した細胞増殖、分化、細胞骨格、細胞運動、食作用、細胞内の蛋白質輸送などの機能調節の解明が期待される。この研究目的をふまえて、今年度行った研究の成果を以下に示す。1.ポリクローナル抗体作成FPP合成酵素とGGPP合成酵素を多量(1mg)に得るために、ゲラニルメチルホスホノホスフェートあるいはファルネシルメチルホスホノホスフェートをリガントするアフィゲル10をそれぞれ10ml合成した。ウシの大脳(約3kg)を用いて一段階の精製法により、現在FPP合成酵素を500μgそしてGGPP合成酵素2mgを得ている。MonoQクロマトグラフィーによる更なる精製により、目的とするポリクローナ抗体作成が可能になると思われる。2.GGPP合成酵素のクローニングスラブ電気泳動法において精製GGPP合成酵素に相当する蛋白バンドを切り出し、そのプロテアーゼ消化によって得られる部分ペプタイドアミノ酸配列を決定した。(1)KAYK(2)KHLSK(3)KMFK(4)KTQETVQGILXEPY(5)KQISARGGNPXGPである。これを基に、KHLSKとQET-VQに相当するオリゴヌクレオチドを合成した。ウシ大脳よりmRNAを調製し、PCRによる増幅反応をおこなった。その結果200bpに相当するPCR産物を同定することができた。このプローブを用いてGGPP合成酵素のクローニングが容易になると思われる。