PCR法を利用した両生類胚の背腹軸決定因子の探索

本研究の目的は、両生類の初期胚における背腹軸の決定に関与する因子の分子的実態を探ることにある。そのため、differential display of PCR法を8‐16 cell stageのXenopus胚に適用することを試みた。まず、8‐16 cell stageのXenopus胚を背腹に分けてサンプリングするため、ジェリー層を除去した2‐cell stageの胚をCa^<++>,Mg^<++> freeのPBS中で発生させ8‐16 cell stageに達した段階で受精膜をはずし、各部域ごとの割球に解離して集め液体窒素を用いて急速に凍結保存することを試みた。次に、それぞれの凍結サンプルからグアニディウムチオシアネートを用いて、酸性フェノール、クロロホルム抽出法で、トータルRNAを得た。これらのRNAを出発点として、polyA primerを使ってのcDNAへの逆転写、polyTおよびランダムprimerを用いてのPCR、その産物の電気泳動による解析を試みつつある。残念ながら現時点において常に背側だけに特異的に出現する安定した産物はえられていない。今後これを繰り返し試み、目的の(背側に特異的なmRNA)の検出に勤める予定である。一方で、上記方法で得られたcDNA断片をプローブにしてスクリーニングするために、8‐16 cell stageのXenopus胚からcDNAライブラリーを作製した。その結果、10^6程度のpfa/mlのライブラリーを得ている。また、上記の方法で何等かの因子が得られた時の、バイオアッセイの方法(のXenopus初期胚へのマイクロインジェクション、Xenopus初期胚を材料としたin situハイブリダイゼーション)の確立も同時にを試みつつある。

本研究の目的は、両生類の初期胚における背腹軸の決定に関与する因子の分子的実態を探ることにある。そのため、differential display of PCR法を8‐16 cell stageのXenopus胚に適用することを試みた。まず、8‐16 cell stageのXenopus胚を背腹に分けてサンプリングするため、ジェリー層を除去した2‐cell stageの胚をCa^<++>,Mg^<++> freeのPBS中で発生させ8‐16 cell stageに達した段階で受精膜をはずし、各部域ごとの割球に解離して集め液体窒素を用いて急速に凍結保存することを試みた。次に、それぞれの凍結サンプルからグアニディウムチオシアネートを用いて、酸性フェノール、クロロホルム抽出法で、トータルRNAを得た。これらのRNAを出発点として、polyA primerを使ってのcDNAへの逆転写、polyTおよびランダムprimerを用いてのPCR、その産物の電気泳動による解析を試みつつある。残念ながら現時点において常に背側だけに特異的に出現する安定した産物はえられていない。今後これを繰り返し試み、目的の(背側に特異的なmRNA)の検出に勤める予定である。一方で、上記方法で得られたcDNA断片をプローブにしてスクリーニングするために、8‐16 cell stageのXenopus胚からcDNAライブラリーを作製した。その結果、10^6程度のpfa/mlのライブラリーを得ている。また、上記の方法で何等かの因子が得られた時の、バイオアッセイの方法(のXenopus初期胚へのマイクロインジェクション、Xenopus初期胚を材料としたin situハイブリダイゼーション)の確立も同時にを試みつつある。