PCR法を利用した両生類胚の背腹軸決定因子の探索

用PCR方法寻找决定两栖动物胚胎背腹轴的因素

• 批准号: 06680721
• 负责人: 小早川 義尚
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680721/
• 关键词: PCR; Xenopus; 背腹軸; mRNA

本研究の目的は、両生類の初期胚における背腹軸の決定に関与する因子の分子的実態を探ることにある。そのため、differential display of PCR法を8‐16 cell stageのXenopus胚に適用することを試みた。まず、8‐16 cell stageのXenopus胚を背腹に分けてサンプリングするため、ジェリー層を除去した2‐cell stageの胚をCa^<++>,Mg^<++> freeのPBS中で発生させ8‐16 cell stageに達した段階で受精膜をはずし、各部域ごとの割球に解離して集め液体窒素を用いて急速に凍結保存することを試みた。次に、それぞれの凍結サンプルからグアニディウムチオシアネートを用いて、酸性フェノール、クロロホルム抽出法で、トータルRNAを得た。これらのRNAを出発点として、polyA primerを使ってのcDNAへの逆転写、polyTおよびランダムprimerを用いてのPCR、その産物の電気泳動による解析を試みつつある。残念ながら現時点において常に背側だけに特異的に出現する安定した産物はえられていない。今後これを繰り返し試み、目的の(背側に特異的なmRNA)の検出に勤める予定である。一方で、上記方法で得られたcDNA断片をプローブにしてスクリーニングするために、8‐16 cell stageのXenopus胚からcDNAライブラリーを作製した。その結果、10^6程度のpfa/mlのライブラリーを得ている。また、上記の方法で何等かの因子が得られた時の、バイオアッセイの方法(のXenopus初期胚へのマイクロインジェクション、Xenopus初期胚を材料としたin situハイブリダイゼーション)の確立も同時にを試みつつある。

The purpose of this study is to を explore the actual state of molecules related to the に determination of the における dorsal and ventral axis <e:1> and the する factor <e:1> in the early embryo of ryosaurids を. Youdaoplaceholder0 ため ため, differential display of PCR method を 8-16 cell stage <s:1> Xenopus embryo に applicable する とを とを みた test みた. ま ず, 8 ‐ 16 cell stage の Xenopus embryo を に points back an abdomen け て サ ン プ リ ン グ す る た め, ジ ェ リ ー layer を removed し た 2 ‐ cell stage の embryo を Ca ^ < + + >, Mg ^ < + + > free の in PBS で 発 raw さ せ 8 ‐ 16 cell Stage に da し た Duan Jie で fertilization membrane を は ず し, each domain ご と の cut the ball に dissociation し て set め liquid を smothering element with い て に rapidly freeze preserved す る こ と を try み た. に, そ れ ぞ れ の freeze サ ン プ ル か ら グ ア ニ デ ィ ウ ム チ オ シ ア ネ ー ト を with い て, acidic フ ェ ノ ー ル, ク ロ ロ ホ ル ム extraction method で, ト ー タ ル RNA を た. こ れ ら の RNA を と 発 point し て, polyA primer を make っ て の cDNA へ の inverse planning write, polyT お よ び ラ ン ダ ム primer を with い て の PCR, そ の product の electric 気 swimming に よ る parsing を try み つ つ あ る. Remnants read aloud な が ら now point に お い て often に dorsal だ け に specific に appear す る settle し た product は え ら れ て い な い. In the future, <s:1> れを will return to the み test, and the target <s:1> (dorsal に specific なmRNA) 検 検 will be available for に and める as determined である. Party で, written method で ら れ た cDNA fragment を プ ロ ー ブ に し て ス ク リ ー ニ ン グ す る た め に, 8 ‐ 16 cell stage の Xenopus embryo か ら cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を cropping し た. Youdaoplaceholder0 そ result, 10^6 degree <s:1> pfa/ml <s:1> ラ ブラリ ブラリ を を て る る る. ま た, written の way how か で の factor が must ら れ た の, バ イ オ ア ッ セ イ の way (の Xenopus early embryo へ の マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン, the early Xenopus embryo を materials と し た in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン) も の established at the same time に を try み つ つ あ る.