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Drosophilaの同定細胞を用いたKチャネルの研究

使用果蝇鉴定细胞研究 K 通道

基本信息

批准号：
07640913
负责人：
小松明
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Drosophila melanogasterの野生型(Canton-S)の3令幼虫の中腸をリンゲル液中で解剖、摘出、切開して細胞を取り出した後、1mg/mlのCollagenaseを含むリンゲル液中に1時間室温で放置し、130mM KCl溶液で洗浄して、中腸細胞膜由来のベシクルを形成した。溶液は130mM KClを基準とし、K^+濃度を減らす場合はNaClで置換した。パッチ電極の抵抗は5-15megaohm、シール抵抗は5-20gigaohmであった。gigaohmseal形成後、inside-out patchにし、単一チャネル電流を記録した。記録はList社のパッチクランプアンプEPC-7を用い、ディジタルテープにストア後、サーマルアレイレコーダーで記録紙に描記、解析した。記録された単一チャネル電流は2種類あった。両者とも電圧非感受性のイオンチャネルであった。1種類は稀にしか記録されなかったので、主に記録されたイオンチャネルの性質について述べる。生体に近いイオン環境条件(2.5mM Ko/130mM Ki)では、単一チャネル電流は外向き電流とした記録され、右上がりの電圧-電流曲線(I-Vカーブ)を示した。OmVでの単一チャネル電流は1.8±0.4pA(平均±標準偏差、以下同様、n=15)、単一チャネルコンダクタンスは47.4±13.2pS(n=14)であった。また、この条件では、50mV〜+50mVの範囲では反転電位は得られなかった。細胞内外が130mK K^+の対称的な条件ではI-Vカーブは0をよぎる直線となり、単一チャネルコンダクタンスは88.1±12.0pS(n=10)であった。この値はDrosophila幼虫筋細胞のCa^<++>感受性K^+チャネルの単一チャネルコンダクタンス(83±12pS)に近い値である。しかし、Ca^<++>感受性K^+チャネルがflickering burst様の活動を示して開確率が大きいのに対して、このチャネルの開確率は小さかった。さらに、65mM Ko/130mM Kiの条件で反転電位を求めたところ、13.4±3.3mV(n=12)であり、この値からNa^+とK^+のイオン透過比を計算するとPNa/PK=0.18となった。即ち、K^+に対する透過性がNa^+に比べ、約5倍高く、K^+に対する選択性の高いことが分かった。さらに、2.5mM Ko/130mM Kiの条件下で、K^+チャネルに対する選択的遮断剤であるテトラエチルアンモニウム(TEA)を細胞内膜側に与えたところ、50mM TEAで0mVでの単一チャネル電流がコントロールの50%と減少した。一方、もうひとつの種類の単一チャネル電流は2.5mM Ko/130mM Kiの条件下では0mVで1.1±0.3pA(n=3)と、先述のイオンチャネルよりも小さかった。なお、胚中枢神経系のグリア細胞と成虫背板剛毛の機会感覚受容ニューロンについては現在引き続き研究中である。

The midgut cells of 3-instar larvae of Drosophila melanogaster (Canton-S) were dissected, extracted, and dissected. After cells were extracted, Collagenase (1mg/ml) was added to the solution containing Collagenase for 1 hour at room temperature. After washing with 130mM KCl solution, the midgut cell membrane was formed. The solution is 130mM KCl, K^+ and NaCl. The electrode resistance is 5-15megaohm, the resistance is 5-20gigaohm. After gigaohmseal formation, inside-out patch, single-chip current recording Record the List of the company's file name, file, file name, file, file name, file name, file Record the current of 2 kinds.両者とも电圧非感受性のイオンチャネルであった。1. The nature of the species is described in detail. In vivo, near environmental conditions (2.5 mM Ko/130mM Ki), the current curve (I-V curve) is shown. OmV single cycle current was 1.8±0.4pA(mean ± standard deviation, following identity, n=15), single cycle current was 47.4±13.2pS(n=14). The voltage range of 50mV to +50 mV is the maximum voltage. The conditions for the relationship between 130mK ^+ in and out of the cell are as follows: I-V 0 This value is close to the Ca^<++> sensitivity K^+ of Drosophila larva muscle cells (83±12pS). The sensitivity of K^+ to Flickering Burst activity is higher than that of Ca^+. The accuracy of Flickering Burst activity is lower than that of Ca ^+. Under the condition of 65mM Ko/130mM Ki, the reverse potential was calculated as 13.4± 3.3 mV (n=12), and the transmission ratio was calculated as PNa/PK=0.18. That is, the permeability of K^+ is about 5 times higher than that of Na^+, and the selectivity of K^+ is higher than that of Na ^+. Under the conditions of 2.5 mM Ko/130mM Ki, the selected blocking agent for K^+ cell growth was 50% lower than that for TEA at 0mV on the intracellular side. In one case, under the condition of 2.5 mM Ko/130mM Ki, the current of the cell was 0mV or 1.1± 0.3 pA (n=3). The changes of embryonic central nervous system and the changes of adult dorsal setae were studied.