KLF4DNA結合部位アミノ酸残基の機能解析から改良リプログラミング因子の開発

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本研究はiPS細胞へリプログラミングするのに利用されているKLF4タンパク質について、DNAと直接相互作用することが見出されたアミノ酸残基の機能解析を実施し、リプログラミング能に必須なアミノ酸残基を同定し、KLF4タンパク質の構造と機能の知見から、野生型タンパク質よりも優れたリプログラミング能を持つ「人工リプログラミング因子」の開発を目指した。予備検討で見出したKLF4ジンクフィンガードメイン（ZFD）内でDNAと相互作用するアミノ酸残基一つ一つの重要性を評価するために、アミノ酸残基の機能を打ち消したアラニン置換変異体を作製した。これらの変異体コンストラクトにはN末端に3xFLAGタグを融合しておき、以下の実験を行った。1. 哺乳類細胞内のタンパク質発現量と寿命の測定：野生型、変異型それぞれのKLF4を遺伝子導入した哺乳類細胞をシクロへキシミド処理によってタンパク質翻訳を停止させた。その後、異なった時間に細胞からタンパク質を回収し、FLAGタグに対するWestern Blottingによって各KLF4変異体のタンパク量を測定した。2. iPS細胞へのリプログラミング能の測定：それぞれの野生型、変異型KLF4を他のリプログラミング因子（OCT4, SOX2, MYC)と共にマウス胎児繊維芽細胞（Nanog-GFP MEF)に遺伝子導入し、iPS細胞作製を試みた。作製されたNanog-GFP陽性コロニーの数を数日ごとに計測し、リプログラミングの効率と速さをそれぞれ解析した。以上から総合的に判断して、どのアミノ酸残基がKLF4の分子基盤として重要なのかを評価した。さらに、野生型より強いリプログラミング能を持つ変異型を探索した。