KLF4DNA結合部位アミノ酸残基の機能解析から改良リプログラミング因子の開発

通过 KLF4 DNA 结合位点氨基酸残基的功能分析开发改进的重编程因子

• 批准号: 16H06662
• 负责人: 林 洋平
• 金额: $ 1.91万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-08-26 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16H06662/
• 关键词: iPS細胞; リプログラミング; 転写因子; タンパク質構造; KLF4; タンパク質工学; 発現制御; 細胞・組織; バイオテクノロジー; 蛋白質; 再生医学

本研究はiPS細胞へリプログラミングするのに利用されているKLF4タンパク質について、DNAと直接相互作用することが見出されたアミノ酸残基の機能解析を実施し、リプログラミング能に必須なアミノ酸残基を同定し、KLF4タンパク質の構造と機能の知見から、野生型タンパク質よりも優れたリプログラミング能を持つ「人工リプログラミング因子」の開発を目指した。予備検討で見出したKLF4ジンクフィンガードメイン（ZFD）内でDNAと相互作用するアミノ酸残基一つ一つの重要性を評価するために、アミノ酸残基の機能を打ち消したアラニン置換変異体を作製した。これらの変異体コンストラクトにはN末端に3xFLAGタグを融合しておき、以下の実験を行った。1. 哺乳類細胞内のタンパク質発現量と寿命の測定：野生型、変異型それぞれのKLF4を遺伝子導入した哺乳類細胞をシクロへキシミド処理によってタンパク質翻訳を停止させた。その後、異なった時間に細胞からタンパク質を回収し、FLAGタグに対するWestern Blottingによって各KLF4変異体のタンパク量を測定した。2. iPS細胞へのリプログラミング能の測定：それぞれの野生型、変異型KLF4を他のリプログラミング因子（OCT4, SOX2, MYC)と共にマウス胎児繊維芽細胞（Nanog-GFP MEF)に遺伝子導入し、iPS細胞作製を試みた。作製されたNanog-GFP陽性コロニーの数を数日ごとに計測し、リプログラミングの効率と速さをそれぞれ解析した。以上から総合的に判断して、どのアミノ酸残基がKLF4の分子基盤として重要なのかを評価した。さらに、野生型より強いリプログラミング能を持つ変異型を探索した。

In this study, we used the direct interaction of iPS and DNA to determine that the acid residues of acid residues could be analyzed, that the acid residues of acid residues must be identified, that the acid residues of KLF4 should be determined, that the acid residues of acid residues must be identified, that the acid residues of acid residues must be identified, that the acid residues of acid residues must be identified, that the acid residues of acid residues must be identified, and that the acid residues must be identified, the results of this study were determined by the direct interaction of DNA and DNA. The wild-type virus is able to control the "artificial virus" and the target target. In order to determine the importance of acid residues in the DNA interaction (ZFD), it is necessary to determine the importance of acid residues in the ZFD system. The following is the following: body, N-terminal, 3xFLAG, fusion, row, etc. 1. Measurement of the lifespan of mammalian intracellular KLF4: wild type, wild type and wild type. After that, you will need to check the time to check the return time, and the FLAG will send you the Western Blotting to check the accuracy of the measurement of each KLF4 system. 2. IPS cell cycle assay: wild type and type KLF4 cell cycle factor (OCT4, SOX2, MYC) were measured, and iPS cells were tested. Make sure that you can count the number of days in which you want to Nanog-GFP the number of days, and that the rate of speed will increase. The determination of the above compounds, the acid residues, the KLF4 molecular groups, the important ones, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the molecular groups, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the molecular groups, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the molecular groups, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the molecular groups, the acid residues, the molecular groups, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the acid residues, the molecular groups, the acid residues, the acid residues, the molecular groups, the acid residues, the molecular groups, The wild type and the wild type are able to maintain the type of exploration.

项目成果

BMP-SMAD-ID promotes reprogramming to pluripotency by inhibiting p16/INK4A-dependent senescence

• DOI: 10.1073/pnas.1603668113
• 发表时间: 2016-11-15
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Hayashi, Yohei;Hsiao, Edward C.;Yamanaka, Shinya
• 通讯作者: Yamanaka, Shinya

Structure-based discovery of NANOG variant with enhanced properties to promote self-renewal and reprogramming of pluripotent stem cells

• DOI: 10.1073/pnas.1502855112
• 发表时间: 2015-04-14
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Hayashi, Yohei;Caboni, Laura;Fletterick, Robert J.
• 通讯作者: Fletterick, Robert J.