高分解能走査電子顕微鏡を用いた2つの精細胞の受精相手決定機構の解析

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本年度は、これまでに同定されている受精の際の膜融合関連因子であるGCS1に着目した。膜融合因子が受精相手の細胞側に極在しているか、光電子相関顕微鏡法（CLEM法）を用いた解析と、その変異体であり膜融合せず受精直前の状態を維持できるgcs1変異体を用いて、受精直前における精細胞と受精領域の微細構造はどのようであるか、野生型を用いた受精後の微細構造変化を透過型電子顕微鏡（TEM）で解析した。まず、胚珠を一定の角度で効率よく切片作製が行えるように試料調整法を検討した。TEM観察のためには実体顕微鏡下で胚珠を一つずつピラミッド型の包埋モルドに方向を調整しながら埋めた。CLEM法では胚珠が透明になり扱いが難しくなるので、ポリリジンコートしたアクラフィルムに胚珠の向きを揃えて付着させて、このフィルムごと試料調整から包埋まで行う事で効率よく観察できる方法を確立した。これらにより、受精直前のgcs1変異体の精細胞の微細構造解析することに成功した。受精前のgcs1変異体の精細胞は卵細胞、中央細胞の両方に密に接していた。またCLEM法では蛍光を維持するために固定の際に四酸化オスミウムを用いないため、固定が不十分になり微細構造が崩れることがあり、今後は固定法の改良が必要であることがわかった。受精能が欠損したgcs1変異体において花粉管から放出された精細胞を観察することができたので、次にSemi-in vivo受精系を用い、花粉管の精細胞放出が起きた胚珠をピックアップして瞬間的に固定する加圧凍結法を用いた微細構造解析を試みた。これにより、受精直前の精細胞を観察する事に成功した。一つの精細胞しか観察できなかったため、受精直前精細胞における卵細胞と中央細胞との接着面積の比較等、反復観察が必要である。