雄因子と共に配偶子膜融合を担う雌因子の同定と解析：重複受精分子メカニズムの解明

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R4年度では，配偶子膜融合因子であるGCS1と相互作用するタンパク質種のプロテオーム解析結果より，検出信頼度が高いタンパク質種の中から「雌性組織での発現が期待されるもの」，「推定膜貫通領域を有するもの（あるいは膜局在シグナル配列を有するもの）」を主な指標として，その後の生化学及び分子生物学的解析の対象となるタンパク質種を数種選抜した。これらのタンパク質種とGCS1との相互作用を再検証するために，生化学的評価を行った。生化学的評価ではin vitroタンパク質合成とpull-downアッセイを行った。その結果，3種のタンパク質種においてGCS1との相互作用が示唆された。また別に，ベンサミアナタバコでのタンパク質発現による相互作用評価を行うため，遺伝子導入用のベクターを構築して，解析のツールを整備したた。解析対象タンパク質種に関して局在解析を行うため，内在性プロモーターからCDSを含む領域をクローニングして，C末端側にGFP遺伝子を融合させた遺伝子発現コンストラクトを作製した。これらコンストラクトを導入したシロイヌナズナ遺伝子組換え体を得た。上記タンパク質種において，タンパク質種Aについては，雌性配偶子の原形質膜上の局在が確認された。機能解析を行うべく，ゲノム編集によって遺伝子Aの変異個体を作出した。しかし遺伝子変異と表現型の相関が安定せず，再検証の準備を進めた。また別のタンパク質種Bについては，CRISPR/Cas9によるゲノム編集を行い，遺伝子組換え体第1世代の種子が獲得できた。