ウサギES細胞からの始原生殖細胞誘導法とそれを用いた生殖系列キメラ作製法の開発

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平成 29年度はウサギ ES 細胞から始原生殖細胞 (PGC) への効率的な分化誘導のための条件決定と、ウサギ胚発生における PGC の段階的な解析を試みた。分化誘導ではまずウサギ ES 細胞の最適な培養条件を決定するため、未分化マーカーである NANOG の遺伝子座に tdTomato をノックインしたウサギ ES 細胞を用い、未分化性を維持しながら安定して増殖可能な培養条件をサイトカインやシグナル阻害剤の添加を組み合わせて検討した。いくつかの条件では、NANOG を均一に高発現しながら、安定して培養が可能で、それを起点として分化誘導に進んだ。ウサギ PGC への分化誘導法は、研究代表者らが開発したヒト ES 細胞から PGC への分化誘導法をウサギへ最適化することを試みた。分化の指標として、PGC を特異的に可視化・定量化できるように、PGC 特異的な遺伝子である NANOS3 もしくは PGC の分化に必須な遺伝子 SOX17 の内在性遺伝子 C 末端に T2A-tdTomato をノックインしたレポーターを持つウサギ ES 細胞を樹立した。最適化の結果、まだ低率かつ不安定ではあるが、レポーターが陽性になる条件も見つかりつつあり、今後更なる改良を加える予定である。また並行して、PGC を移植し生殖系列キメラを作製するために基盤となる知見を得るため、ウサギ胚発生過程における PGC の組織学的解析を行った。その結果、ウサギ胚において PGC が出現する時期などを特定しつつある。また次年度に計画予定の PGC の移植を想定して、マイクロマニピュレーターを用いウサギ胚への顕微操作も行った。