iPS細胞由来立体網膜組織を用いた常染色体優性視神経萎縮症の病態解明

平成30年度はヒトiPS細胞由来立体網膜組織から網膜神経節細胞を効率的に単離精製する方法として、Immunopanning法とMACS法での比較検討を行った。具体的には、Immunopanning法では抗マクロファージ抗体と抗Thy1抗体で単離するのに対して、MACS法ではより簡易的に単離すること目的として抗Thy1抗体のみで単離を行った。また、立体網膜組織の維持培養期間に関してもこれまでの100日前後から、50日から75日に短縮して比較検討を行った。その結果、MACS法では維持培養期間が短くても単離した網膜神経節細胞の方が有意に長い神経突起伸長を認め、網膜神経細胞の観察研究には適していることが示唆された。また、立体網膜組織及び網膜神経節細胞の神経突起におけるミトコンドリアの局在をCellLight Mitochondria-GFPを用いてイメージング及び免疫染色を施行した。今後はミトコンドリア障害や緑内障関連神経障害によるタイムラプスな観察を行い、軸索輸送の変化を確認する。また、立体網膜組織に神経障害を与えた際のミトコンドリア関連マーカーの推移をRT-qPCR法を用いて測定したところ、発現の減少が確認され、神経障害とミトコンドリアの関連が示唆された。本年度は、常染色体優性視神経症患者由来のiPS細胞が樹立出来次第、立体網膜組織への分化誘導を行い、網膜神経節細胞を単離して正常人との比較検討を行う予定である。

平成30年度はヒトiPS細胞由来立体網膜組織から網膜神経節細胞を効率的に単離精製する方法として、Immunopanning法とMACS法での比較検討を行った。具体的には、Immunopanning法では抗マクロファージ抗体と抗Thy1抗体で単離するのに対して、MACS法ではより簡易的に単離すること目的として抗Thy1抗体のみで単離を行った。また、立体網膜組織の維持培養期間に関してもこれまでの100日前後から、50日から75日に短縮して比較検討を行った。その結果、MACS法では維持培養期間が短くても単離した網膜神経節細胞の方が有意に長い神経突起伸長を認め、網膜神経細胞の観察研究には適していることが示唆された。また、立体網膜組織及び網膜神経節細胞の神経突起におけるミトコンドリアの局在をCellLight Mitochondria-GFPを用いてイメージング及び免疫染色を施行した。今後はミトコンドリア障害や緑内障関連神経障害によるタイムラプスな観察を行い、軸索輸送の変化を確認する。また、立体網膜組織に神経障害を与えた際のミトコンドリア関連マーカーの推移をRT-qPCR法を用いて測定したところ、発現の減少が確認され、神経障害とミトコンドリアの関連が示唆された。本年度は、常染色体優性視神経症患者由来のiPS細胞が樹立出来次第、立体網膜組織への分化誘導を行い、網膜神経節細胞を単離して正常人との比較検討を行う予定である。