植物におけるリボソームRNA合成装置の同定と機能解析

本研究では、植物の核内においてrRNA合成を行う、RNAポリメラーゼI(Pol I)に加えて、Pol Iと協調的に機能する転写因子群を同定・機能解析する事により、植物におけるrRNA合成制御機構を明らかにする事を目的にしており、以下2項目についての研究を行った。1. rRNA合成反応におけるTORの役割(1) TORとTBP, Rrn3との結合の検証:まず、クロマチン免疫沈降解析により、TBPとRrn3が、rDNAプロモーター領域に特異的に結合していること、つまり、rRNA合成に寄与する因子である事を明らかにした。その後、pBrpと同様に、TORと複合体を形成するか否かについて、TORに対する抗体を用いた免疫沈降実験にて解析した。その結果、TBPとRrn3は、pBrpとは異なり、TORと複合体を形成しない事が明らかになった。(2) TOR-pBrp結合量と新規合成rRNA合成量との関係:TORとpBrpの結合量の変化と、新規合成rRNA量との相関関係をRun-on解析法にて調査した。その結果、両者の間に正の相関関係が認められた。(3) 細胞内局在解析:免疫染色法による局在解析を行ったが、バックグラウンドが高いため、細胞固定法や、染色方法などの最適化を行った。2. 植物Pol Iの構成因子とPol Iと協調して機能する転写因子の同定と機能解析(1) Pol I複合体の精製:Pol Iのサブユニットにタグを付加する試みを行ったが、現時点までに形質転換体の取得に成功していない。(2) Pol Iと協調的に機能する転写因子群の同定:酵母ツーハイブリット法にて、Pol Iと結合する因子の同定を試みた。その結果、7個の遺伝子の同定に成功した。

本研究では、植物の核内においてrRNA合成を行う、RNAポリメラーゼI(Pol I)に加えて、Pol Iと協調的に機能する転写因子群を同定・機能解析する事により、植物におけるrRNA合成制御機構を明らかにする事を目的にしており、以下2項目についての研究を行った。1. rRNA合成反応におけるTORの役割(1) TORとTBP, Rrn3との結合の検証:まず、クロマチン免疫沈降解析により、TBPとRrn3が、rDNAプロモーター領域に特異的に結合していること、つまり、rRNA合成に寄与する因子である事を明らかにした。その後、pBrpと同様に、TORと複合体を形成するか否かについて、TORに対する抗体を用いた免疫沈降実験にて解析した。その結果、TBPとRrn3は、pBrpとは異なり、TORと複合体を形成しない事が明らかになった。(2) TOR-pBrp結合量と新規合成rRNA合成量との関係:TORとpBrpの結合量の変化と、新規合成rRNA量との相関関係をRun-on解析法にて調査した。その結果、両者の間に正の相関関係が認められた。(3) 細胞内局在解析:免疫染色法による局在解析を行ったが、バックグラウンドが高いため、細胞固定法や、染色方法などの最適化を行った。2. 植物Pol Iの構成因子とPol Iと協調して機能する転写因子の同定と機能解析(1) Pol I複合体の精製:Pol Iのサブユニットにタグを付加する試みを行ったが、現時点までに形質転換体の取得に成功していない。(2) Pol Iと協調的に機能する転写因子群の同定:酵母ツーハイブリット法にて、Pol Iと結合する因子の同定を試みた。その結果、7個の遺伝子の同定に成功した。