昆虫工場における組換えタンパク質生産性改善のための新規指向性進化法の開発

本研究は、カイコに感染するバキュロウイルスに、昆虫生体内において目的遺伝子の変異導入と優良変異体の効率的な選抜という指向性進化のサイクルを実行させ、カイコ-バキュロウイルス発現系における組換えタンパク質の生産性改善を分子進化によって可能にすることを目的とする。そのために、(1)昆虫細胞内で特定のDNA領域内にランダムな変異を導入する技術の確立と、(2)優良な変異体が効率的に選抜されるような技術を開発し、これらの技術を統合して、(3)カイコで少量しか作れない難発現性の組換えタンパク質の指向性進化による生産性改善を目指す。本年度は、(1)のランダム変異導入において、変異導入酵素融合T7RNAポリメラーゼを発現する組換えバキュロウイルスを作製し、実際にT7プロモータ直下の領域に変異導入可能かどうかを調べた。組換えウイルスをカイコに感染させることで目的の酵素自体の大量発現は認められた。一方で、カイコ内で増殖したウイルス粒子からゲノムを抽出し、次世代シークエンサーで解析したが、顕著な変異を検出することができなかった。(2)では、優良変異体が自動選抜されるようなシステムに利用するため、まずはノックアウトするとバキュロウイルスの効率的な増殖に影響がある遺伝子8種類をそれぞれバキュロウイルスのゲノムから削除し、次にそれぞれの遺伝子をレスキューしたときにウイルスの増殖性が回復するかを調べている。各遺伝子のKOウイルス作製には大腸菌内でのRed組換えを使用しており、初期に遺伝子欠損ゲノムを得ることがなかなかうまくいかなかったが、系を見直すことで遺伝子欠損ゲノムが得られるようになったため、現在、遺伝子欠損ウイルスを順次作製している最中である。

本研究は、カイコに感染するバキュロウイルスに、昆虫生体内において目的遺伝子の変異導入と優良変異体の効率的な選抜という指向性進化のサイクルを実行させ、カイコ-バキュロウイルス発現系における組換えタンパク質の生産性改善を分子進化によって可能にすることを目的とする。そのために、(1)昆虫細胞内で特定のDNA領域内にランダムな変異を導入する技術の確立と、(2)優良な変異体が効率的に選抜されるような技術を開発し、これらの技術を統合して、(3)カイコで少量しか作れない難発現性の組換えタンパク質の指向性進化による生産性改善を目指す。本年度は、(1)のランダム変異導入において、変異導入酵素融合T7RNAポリメラーゼを発現する組換えバキュロウイルスを作製し、実際にT7プロモータ直下の領域に変異導入可能かどうかを調べた。組換えウイルスをカイコに感染させることで目的の酵素自体の大量発現は認められた。一方で、カイコ内で増殖したウイルス粒子からゲノムを抽出し、次世代シークエンサーで解析したが、顕著な変異を検出することができなかった。(2)では、優良変異体が自動選抜されるようなシステムに利用するため、まずはノックアウトするとバキュロウイルスの効率的な増殖に影響がある遺伝子8種類をそれぞれバキュロウイルスのゲノムから削除し、次にそれぞれの遺伝子をレスキューしたときにウイルスの増殖性が回復するかを調べている。各遺伝子のKOウイルス作製には大腸菌内でのRed組換えを使用しており、初期に遺伝子欠損ゲノムを得ることがなかなかうまくいかなかったが、系を見直すことで遺伝子欠損ゲノムが得られるようになったため、現在、遺伝子欠損ウイルスを順次作製している最中である。