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高感度質量分析法の開発に基づく１細胞アミノ酸メタボロミクスへの挑戦

基于高灵敏度质谱技术的发展对单细胞氨基酸代谢组学的挑战

基本信息

批准号：
22K20718
负责人：
古庄仰
金额：
$ 1.83万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-08-31 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20718/
关键词：
1細胞分析アミノ酸メタボロミクス誘導体化質量分析がん

项目摘要

がん組織は不均一で、周辺環境によって代謝が変化することが知られている。そのため、代謝変動の詳細な解析には細胞1個レベルでの測定が望まれる。本研究では、がん細胞におけるアミノ酸メタボロミクスを1細胞レベルで実現することを目指して、誘導体化と質量分析を用いた高感度1細胞分析法の開発を行う。2022年度は、細胞を採取するガラスキャピラリー内での誘導体化に適した試薬および反応条件、分析条件を検討した。ガラスキャピラリーは容積が数十マイクロリットル程度で、誘導体化後に質量分析計で直接測定するため、微小空間での高い反応性と質量分析計での高感度な検出を両立する試薬の選定が必須であった。数種のアミノ酸誘導体化試薬を検討した結果、数マイクロリットルの溶液中でアミノ酸と反応し、エレクトロスプレーイオン化で高効率にイオン化されて質量分析計で高感度に検出される試薬を見出した。誘導体化反応については反応温度、反応時間、反応液のpH等をさらに検討し、簡便かつ迅速な反応手順を構築した。質量分析には三連四重極型質量分析計を採用し、誘導体化試薬に由来する特徴的なプロダクトイオンを用いたMS/MS分析により、誘導体化アミノ酸の高感度かつ選択的な検出を実現した。開発した手法をヒト肝がん由来細胞の分析に適用した結果、細胞内の微量アミノ酸を検出することに成功した。また、同一の誘導体化試薬を用いてLC-MS/MS分析法を構築し、大量細胞から調製した抽出液を測定した。得られたアミノ酸プロファイルは1細胞の測定結果と類似しており、開発した1細胞分析法を用いて細胞内のアミノ酸含量を評価可能であることが示された。さらに、同一の条件で培養した複数個の細胞をそれぞれ測定した結果、細胞間で含量の大きく異なるアミノ酸が存在し、1細胞レベルでの差異解析が可能であることが示唆された。

The tissue is heterogeneous, and the environment is metabolic. Detailed analysis of the metabolic activity of the cell was performed. In this study, the development of a highly sensitive cellular assay was carried out for the induction of somatic mass analysis. In 2022, we will discuss the conditions for induction and analysis in the cell culture. The capacity of the mass spectrometer is tens of times higher than that of the mass spectrometer after induction. The sensitivity of the mass spectrometer is high in small space. The selection of the mass spectrometer is necessary. Several kinds of acid-induced chemical reagents were investigated, and the results showed that the acid reaction rate was high in the solution of several kinds of acid-induced chemical reagents, and the sensitivity of mass spectrometry was high. Inductive reaction temperature, reaction time, reaction solution pH, etc. are discussed in detail, and the reaction process is simple and rapid. Mass analysis: triple-quadrupole mass analyzer is used to detect the high sensitivity of the acid in the induction test. The results of the analysis of the cells and the detection of trace amounts of acid in the cells were successful. The same induction chemistry assay was constructed using LC-MS/MS analysis, and a large number of cell extracts were prepared for determination. The results of the determination of the intracellular acid content in the cells were similar to those obtained by the cellular analysis method. In addition, under the same conditions, a plurality of cells were cultured and analyzed. The results showed that there was a large difference in the content of acid between cells, and the difference in the content of acid between cells could be analyzed.