生物発光蛋白質プロープを用いた植物細胞内活性酸素シグナルの解明

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1.フォラシン導入植物の作出ヒカリカモメガイ由来の活性酸素種(ROS)応答性発光蛋白質・フォラシンを植物細胞内ROSシグナル検出用プローブとして利用可能とするため、アグロバクテリウム感染法を用いてシロイヌナズナおよびタバコ培養細胞への遺伝子導入を行った。将来的にCa^<2+>シグナルとの同時計測を目指すことから、シロイヌナズナではオワンクラゲ由来のCa^<2+>レポーター蛋白質であるエクオリンを導入済みの組換え体への追導入を行い、T1種子5-4gを得た。種子検定の結果からこのうち約650粒が形質転換体であると推測され、耐性マーカーであるBASTAを含む寒天培地上で現在、20個体程度の形質転換体について栽培を進めている。また、タバコ培養細胞ではエクオリン導入株・野生株の両方に対して同様にアグロバクテリウム感染法を用いた遺伝子導入を実施済みであり、形質転換体の選抜を行っている。2.出芽酵母発現系を用いた機能解析フォラシン導入酵母培養液に過酸化水素を投与すると、過酸化水素流入に伴った持続的発光が検出される。この酵母にシロイヌナズナの過酸化水素透過性水チャネルAtTIP1;1を発現させると、フォラシン発光が亢進された。AtTIP1;1を介した過酸化水素の取り込みは処理2分後をピークに減衰するので、AtTIP1;1は酸化ストレス条件において機能抑制される可能性が示唆された。また、点変異導入フォラシンを用いた実験の結果から発光基質であるデヒドロセレンテラジンとの結合に重要なアミノ酸について同定することが出来た。フォラシンの再構成機構が明らかになったことで、発光強度およびROS特異性に優れた発光基質の開発を行えるようになると期待される。